VEGFR1 (IC50 = 0.33 μM); Src (IC50 = 0.33 μM); Abl (IC50 = 1.3 μM)

体外活性：ZM 306416（也称为 CB 676475）是 VEGFR1（血管内皮生长因子受体 1）酪氨酸激酶的有效抑制剂或拮抗剂，IC50 为 0.33 μM，但它也被发现是 EGFR 的抑制剂，IC50 <10nM。使用A549-EGFRB细胞进行EGFRB测定，结果显示ZM 306416对VEGFR表现出抑制活性，IC50值为670 nM。用人类甲状腺滤泡细胞进行测试时。 ZM 306416 治疗可减少 VEGFR2 磷酸化并抑制 p42/44 MAPK 磷酸化的内源稳态水平。总而言之，这些结果证明了 ZM 306416 在临床中的潜在用途。激酶测定：使用如前所述的发光 ADP 产生激酶测定，在由 EGFR、VEGFR1、SRC 和 ABL 激酶组成的一组激酶中评估已确认阳性的活性。在 384 孔形式的剂量反应研究中，使用 12 倍稀释液（一式两份）测量每种化合物的效力，以 10 μM 和 1 μM 化合物浓度作为上限。所有试剂转移均使用 PP-384-M 个人移液器进行。将测试化合物或对照以 1 μL 的体积添加到白色 384 孔微量滴定板（Corning #3570，Corning，NY）的孔中。对照包括 1% DMSO (v/v)（高对照）和 1% DMSO (v/v) 中的 30 μM 星形孢菌素（低对照）。测定缓冲液为 25 mM Hepes/NaOH，pH 7.5，含有 10 mM MgCl2、2 mM TCEP、20 mM β-磷酸甘油和 100 μM Na3VO4；对于面板上的每种激酶，将 4 μL 测定缓冲液中的激酶稀释液添加到孔中，以达到 50 nM 酶的最终浓度。值得注意的是，该组激酶的比活性未知，因此制剂中活性酶的浓度未知。添加酶后，将激酶和化合物在室温下预温育10分钟。然后将 5 μL 含有 ATP 和 Poly(Glu, Tyr) 底物的测定缓冲液溶液的混合物添加到孔中，以达到 200 μM 的终浓度。室温反应45分钟后，每孔加入10 μL ADP-Glo Reagent。孵育40分钟后，加入20μL激酶检测试剂，然后孵育60分钟。发光信号输出在 LEADseeker™ 上测量。使用 SigmaPlot 绘制剂量响应曲线并代表重复的平均数据，误差线对应于回归的标准误差。在测定条件下计算化合物IC50的下限是10 nM。细胞测定：针对一组已建立的细胞系评估已确认命中的抗增殖作用，这些细胞系包括含有野生型 EGFR 的细胞系（A549-EGFRB、A549 和 H2030 细胞系）和含有激活性 L858R EGFR 突变的细胞系（H3255 和 HCC4011）细胞系）。如前所述培养 A549-EGFRB 细胞。如前所述培养 H2030、H3255 和 HCC4011 细胞。 A549 细胞在补充有 10% FBS（PAA Cat.# A15-201）的 F12K 培养基（Invitrogen Cat.# 21127-022）中培养。在 384 孔形式的剂量反应研究中，使用 12 个双倍稀释液（一式两份），以 10 μM 和 1 μM 化合物浓度作为上限，并使用如前所述的 Alamar Blue 活力测定，评估每种化合物的抗增殖作用。对照孔由 1% DMSO (v/v)（高对照）和 1 μM “杀手混合物”于 1% DMSO (v/v)（低对照）组成。最终化合物与细胞的孵育时间为120小时。在使用 SigmaPlot 9.0（Systat Software，San Jose，CA）绘制的剂量反应曲线中，显示了重复的平均数据，并且误差条对应于回归的标准误差。

利用发光 ADP 产生激酶的测定来评估一组激酶中已确认阳性的活性，其中包括 EGFR、VEGFR1、SRC 和 ABL 激酶，如前所述。在 384 孔格式的剂量反应研究中，使用 12 次双倍稀释一式两份测量每种化合物的效力，其中化合物浓度为 10 μM，1 μM 为上限。 PP-384-M 个人移液器用于所有试剂转移。将 1 μL 体积添加到含有测试化合物或对照的白色 384 孔微量滴定板（Corning #3570，Corning，NY）的孔中。对照为 1% DMSO (v/v) 和 1% DMSO (v/v) 中的 30 μM 星形孢菌素（分别为高对照和低对照）。测定缓冲液由 25 mM Hepes/NaOH（pH 7.5）、10 mM MgCl2、2 mM TCEP、20 mM β-磷酸甘油和 100 μM Na3VO4 组成。为了达到 50 nM 酶的终浓度，将 4 μL 测定缓冲液中的激酶稀释液添加到面板上每个激酶的每个孔中。值得注意的是，由于该组激酶的比活性未知，因此制剂中活性酶的浓度未知。添加酶后，将激酶和化合物在室温下预温育十分钟。随后，将 5 μL 包含 ATP 和聚（Glu，Tyr）底物溶液的测定缓冲液混合物引入每个孔中，最终达到 200 μM 的终浓度。在室温下反应 45 分钟后，将 ADP-Glo 试剂 (10 μL) 添加到每个孔中。孵育40分钟后加入20微升激酶检测试剂，还需再孵育60分钟。使用 LEADseekerTM 测量发光信号的输出。重复的平均数据由剂量反应曲线表示，该曲线使用 SigmaPlot 绘制。误差线代表回归的标准误差。测定条件下化合物IC50的计算下限为10 nM。

使用一组已建立的细胞系评估已确认的命中的抗增殖作用，其中包括含有野生型 EGFR 的 A549-EGFRB、A549 和 H2030 细胞系，以及含有激活性 L858R EGFR 突变的 H3255 和 HCC4011 细胞系。如前所述，培养 A549-EGFRB 细胞。如前所述，培养了 H2030、H3255 和 HCC4011 细胞。使用补充有 10% FBS (PAA Cat.# A15-201) 的 F12K 培养基 (Invitrogen Cat.# 21127-022) 培养 A549 细胞。采用 12 倍双倍稀释，以 10 μM 和 1 μM 的化合物浓度为上限，以及前面描述的 Alamar Blue 活力测定，在 384 孔格式的剂量反应研究中评估每种化合物的抗增殖作用。 1% DMSO (v/v) 高对照和 1% DMSO (v/v) 低对照中的 1 μM“杀手混合物”是对照孔的内容物。该化合物需要 120 小时才能与细胞充分孵育。回归的标准误差由使用 SigmaPlot 9.0（Systat Software，San Jose，CA）绘制的剂量反应曲线中的误差条表示。显示重复数据的平均数据。

[1]. Synthesis of a novel biotin-tagged photoaffinity probe for VEGF receptor tyrosine kinases. Bioorg Med Chem Lett. 2006 Jan 1;16(1):129-33.

[2]. A high-content biosensor-based screen identifies cell-permeable activators and inhibitors of EGFR function: implications in drug discovery. J Biomol Screen. 2012 Aug;17(7):885-99.

C16H13CLFN3O2

333.74

333.068

C, 57.58; H, 3.93; Cl, 10.62; F, 5.69; N, 12.59; O, 9.59

690206-97-4

196603-47-1 (HCl);690206-97-4;

Solid powder

1.4±0.1 g/cm3

434.1±45.0 °C at 760 mmHg

216.4±28.7 °C

0.0±1.0 mmHg at 25°C

1.653

4.15

56.27

ClC1C([H])=C([H])C(=C(C=1[H])F)N([H])C1C2=C([H])C(=C(C([H])=C2N=C([H])N=1)OC([H])([H])[H])OC([H])([H])[H]

YHUIUSRCUKUUQA-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C16H13ClFN3O2/c1-22-14-6-10-13(7-15(14)23-2)19-8-20-16(10)21-12-4-3-9(17)5-11(12)18/h3-8H,1-2H3,(H,19,20,21)

N-(4-chloro-2-fluorophenyl)-6,7-dimethoxyquinazolin-4-amine

ZM 306416; ZM-306416; CB 676475; CB676475; CB-676475; ZM306416

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.49 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.49 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。