THZ531

CDK12 (IC50 = 158 nM); CDK13 (IC50 = 69 nM); CDK7 (IC50 = 8.5 μM); CDK9 (IC50 = 10.5 μM)

激酶测定结果表明，THZ531 有效抑制 CDK12 和 CDK13，IC50 分别为 158 nM 和 69 nM；而 CDK7 和 CDK9 的抑制作用较弱 50 倍以上，IC50 分别为 8.5 和 10.5 µM。 THZ531 治疗导致 Jurkat 细胞增殖急剧且不可逆地减少，IC50 为 50 nM。用递增剂量的 THZ531 处理后的 FACS 细胞周期分析显示，表现出亚 G1 含量的细胞数量呈剂量和时间依赖性增加。在实验过程中，在 50 nM THZ531 下，与 DMSO 对照相比，未观察到凋亡细胞百分比增加。较高剂量的 THZ531 会导致明显的膜联蛋白 V 信号，72 小时内有 30% 至 40% 的膜联蛋白 V 阳性细胞被染色。还观察到 THZ531 处理后 Pol II 伸长显着减少[1]。

此外，THZ531与奥拉帕尼的联合治疗显著降低了动物模型中的肿瘤负担。[2]
接下来，在免疫缺陷的NSG小鼠体内测试了该组合。对KMS28皮下肿瘤测试了奥拉帕尼（30mg/kg，每天口服一次，每周五天）和/或THZ 531（10mg/kg，每天腹腔注射一次，每周五天）的效果（图4B）。在治疗的第三周，对肿瘤进行称重（图4C），肿瘤图像已在补充图S3中提供。在联合治疗组中观察到显著的协同作用。用THZ531治疗的小鼠体重略有减轻，但所有小鼠都健康活跃，没有出现毒性迹象。[2]

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这些分子与PARP抑制剂的组合在体外细胞活力和DNA损伤检测中以及在包括PDX在内的多种尤文肉瘤模型中显示出显著的协同作用，在体内没有造血毒性。[3]
由于THZ531未针对体内研究进行优化，我们使用了母体化合物THZ1。我们首先证实了亲代分子和奥拉帕尼在体外的协同作用（图S5A）。然后，我们建立了尤文肉瘤的A673异种移植物小鼠模型，并进行了一项4臂研究，每天两次（BID）治疗赋形剂、10mg/kg THZ1、50mg/kg奥拉帕尼和奥拉帕尼+THZ1的组合，持续40天。奥拉帕尼和THZ1作为单一药物均显著降低了肿瘤生长率并延长了小鼠的存活期（奥拉帕尼组的中位存活率=18天载体、32天THZ1和28天）（图6A、B）。当两种药物联合使用时，观察到肿瘤生长率显著降低（图6A），与载体对照或单一药物相比，联合治疗显著延长了生存期（图6B）。当治疗结束时，联合组中70%的小鼠在第40天仍然存活（图6B）。将小鼠随访至第150天，无需进一步治疗。在第60天，联合组中40%（4/10）的小鼠仍然存活，而载体和单剂组中的所有小鼠都已被处死。此外，联合治疗组中20%的肿瘤已经退化到无法触及的位置（图6B）。为了测试这种治疗策略在尤文肉瘤中的普遍性，我们在使用TC71细胞的第二个异种移植物小鼠模型以及该疾病的患者衍生异种移植物（PDX）小鼠模型中进行了联合体内研究。在TC71异种移植物研究中，THZ1和奥拉帕尼作为单一药物均显著降低了肿瘤生长率并延长了生存期（图6C，D），与单独使用任何一种药物相比，THZ1与奥拉帕尼的联合使用显著降低了癌症生长率（图6C）。与奥拉帕尼组42天、THZ1组38.5天和联合治疗组66.5天相比，赋形剂治疗组小鼠的中位生存期为30.5天（图6D）。此外，我们建立了一种尤文肉瘤的PDX小鼠模型，该模型具有I型EWS/FLI融合，来自诊断时从12岁患者腓骨切除的肿瘤（HSJD-ES-002）。在该模型中，THZ1作为单一药物没有显著减少肿瘤进展（图6E），但显著提高了总体生存率（图6F）。重要的是，THZ1和奥拉帕尼的联合使用显著减少了肿瘤进展，提高了PDX的存活率（图6E，F）：载体，23天；奥拉帕尼，42天；THZ1，44天；联合用药56天。总的来说，这种药物组合比单独使用任何一种药物都能产生更深刻、更持久的反应。 [3]

将 THZ531 或 DMSO 应用于细胞六小时。处理细胞，然后在冷 PBS 中洗涤两次，然后在下面提供的裂解缓冲液中裂解：50 mM Hepes pH 7.4、150 mM NaCl、1% Nonidet P40 替代品、5 mM EDTA、1 mM DTT 和蛋白酶/磷酸酶混合物。澄清后，使用 bio-THZ1 或 bio-TH531 在 4°C 下对裂解物进行过夜下拉。将裂解物在室温下进一步孵育三个小时，以最大限度地形成共价键。之后，将裂解物与链霉亲和素琼脂糖一起在 4°C 下再孵育两到三个小时以进行 Pulldown[1]。

将 Jurkat 细胞以 20,000 个细胞/孔的新鲜培养基接种在 96 孔板中，并用指定浓度的 THZ531 或 DMSO 处理 72 小时。 HAP1 细胞以 12,000 个细胞/孔的新鲜培养基接种在 96 孔板中，24 小时后用指定浓度的 THZ531 处理 72 小时。评估 THZ531 的抗增殖作用。为了评估抑制剂冲洗对 Jurkat 细胞抗增殖的影响，用 THZ531 或 DMSO 处理细胞 6 小时。然后除去含有抑制剂的培养基并与或不与THZ531一起孵育66小时。评估 THZ531 的抗增殖作用。所有增殖测定均以生物学一式三份进行。 IC50 使用非线性回归曲线拟合来确定[1]。

All animal studies were in accordance with protocols approved by Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) at National University of Singapore. NSG mice were purchased from InVivos, Singapore. The mice were kept at Animal Research Facilities at National University of Singapore in a sterile condition at 20–26 °C temperature, 50% humidity, and in a light-controlled environment (12 h light, 12 h dark). Mice were provided food and water ad libitum. They were monitored daily by trained comparative medicine staff for their health and well-being. For the xenograft experiments, MM cell line KMS-28 (3 × 106 cells) were injected subcutaneously into six-week-old NSG mice. Mice were randomly divided into four groups: (1) Oral treatment with Olaparib (30 mg/kg); (2) Intraperitoneal injection with THZ 531 (10 mg/kg); (3) Treatment with both Olaparib and THZ531; (4) Diluent control. The mice received the drug/diluent control five times per week for 3 weeks.[2]

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For the in vivo studies, THZ1 was solubilized in 10% DMSO, 90% D5W, and olaparib was solubilized in 10% DMSO, 90% HPBCD.[3]
THZ1 and olaparib combination study Three million A673 or TC71 cells were subcutaneously implanted into the right flanks of 7–8 week old nude female mice. For PDX studies, 1 mm3 viably frozen tumor chunks were dipped in matrigel and implanted into the right flanks via minor surgery. When tumors measured 100–150 mm3, mice were divided into four groups: vehicle control, THZ1, olaparib, and THZ1 and olaparib in combination. THZ1 was administered IP BID at 10 mg/kg, and olaparib was administered PO BID at 50 mg/kg. Tumors were measured twice per week and mice were followed for survival. Statistical significance was determined by log-rank test for survival curves.[3]

[1]. Covalent targeting of remote cysteine residues to develop CDK12 and CDK13 inhibitors. Nat Chem Biol. 2016 Oct;12(10):876-84.

[2]. THZ531 Induces a State of BRCAness in Multiple Myeloma Cells: Synthetic Lethality with Combination Treatment of THZ 531 with DNA Repair Inhibitors. Int J Mol Sci. 2022 Feb; 23(3): 1207.
[3]. EWS/FLI Confers Tumor Cell Synthetic Lethality to CDK12 Inhibition in Ewing Sarcoma. Cancer Cell . 2018 Feb 12;33(2):202-216.e6.

THZ531 is a member of the class of indoles that is 5-chloro-4-(1H-indol-3-yl)-N-[(3R)-piperidin-3-yl]pyrimidin-2-amine in which the piperidine NH group is substituted by a 4-{[(2E)-4-(dimethylamino)but-2-enoyl]amino}benzoyl group. It is a first-in-class CDK12 and CDK13 covalent kinase inhibitor with IC50 of 158 nM and 69 nM, respectively. It has a role as an apoptosis inducer, an antineoplastic agent and an EC 2.7.11.22 (cyclin-dependent kinase) inhibitor. It is a member of indoles, an organochlorine compound, a N-acylpiperidine, an aminopyrimidine, an enamide, a secondary carboxamide and a secondary amino compound.

C30H32CLN7O2

558.0738

557.23

C, 64.57; H, 5.78; Cl, 6.35; N, 17.57; O, 5.73

1702809-17-3

1702809-17-3

118025540

White to light yellow solid powder

4.1

106

3

6

8

40

880

1

CN(C)C/C=C/C(=O)NC1=CC=C(C=C1)C(=O)N2CCC[C@H](C2)NC3=NC=C(C(=N3)C4=CNC5=CC=CC=C54)Cl

RUBYHLPRZRMTJO-MOVYNIQHSA-N

InChI=1S/C30H32ClN7O2/c1-37(2)15-6-10-27(39)34-21-13-11-20(12-14-21)29(40)38-16-5-7-22(19-38)35-30-33-18-25(31)28(36-30)24-17-32-26-9-4-3-8-23(24)26/h3-4,6,8-14,17-18,22,32H,5,7,15-16,19H2,1-2H3,(H,34,39)(H,33,35,36)/b10-6+/t22-/m1/s1

(E)-N-[4-[(3R)-3-[[5-chloro-4-(1H-indol-3-yl)pyrimidin-2-yl]amino]piperidine-1-carbonyl]phenyl]-4-(dimethylamino)but-2-enamide

THZ-531; THZ531; THZ 53; (R,E)-N-(4-(3-((5-chloro-4-(1H-indol-3-yl)pyrimidin-2-yl)amino)piperidine-1-carbonyl)phenyl)-4-(dimethylamino)but-2-enamide; CHEMBL4163879; THZ 531; THZ-531; (E)-N-[4-[(3R)-3-[[5-chloro-4-(1H-indol-3-yl)pyrimidin-2-yl]amino]piperidine-1-carbonyl]phenyl]-4-(dimethylamino)but-2-enamide; THZ531 HCl;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 100~250 mg/mL (179.2~448 mM)
Ethanol: ~4 mg/mL (~7.2 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1.43 mg/mL (2.56 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 14.3 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 1.43 mg/mL (2.56 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 14.3mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 1.43 mg/mL (2.56 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 14.3 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。