TAE684 (NVP-TAE684)

ALK (IC50 = 2-10 nM)

体外活性：TAE684 不表现出与其他激酶的显着交叉反应性。 TAE684 有效抑制 Ba/F3 NPM-ALK 细胞的增殖，IC50 为 3 nM，即使浓度为 1 μM 也不影响 Ba/F3 细胞的存活。 TAE684 还抑制表达 NPM-ALK 的人 ALCL 细胞系（包括 Karpas-299 和 SU-DHL-1）的增殖，IC50 为 2-5 nM。分子模型表明，L258 可能是 TAE684 的主要激酶选择性决定因素之一。 TAE684 处理可快速且持续地抑制 NPM-ALK 的磷酸化。 TAE684 在表达 NPM-ALK 的 Ba/F3 细胞和 ALCL 患者细胞系中诱导细胞凋亡和 G1 期阻滞。 TAE684 显着克服了 H3122 CR 细胞对克唑替尼的耐药性，携带融合癌基因 EML4-ALK，减少细胞生长，抑制 ALK 磷酸化并诱导细胞凋亡。由 mALK R1279Q 突变体表达诱导的神经突生长可被 30 nM 的 TAE684 完全抑制。激酶测定：除 InsR 和 IGF-1R 外，所有体外酶测定均在 Upstate Biotechnology 进行。为了确定 TAE684 对 InsR 和 IGF-1R 的 IC50，进行了均相时间分辨荧光测定。在激酶反应缓冲液存在下，将 ATP (10 mM) 和 20 mg/ml 生物素化 PolyEY（Glu、Tyr 4:1）与 50 nL 系列稀释的 TAE684 (10-500 nM) 和 4 ng InsR 酶混合（20 mM TrisCl，pH 7.5/10 mM MgCl2/3 mM MnCl2/1 mM DTT/10 mM NaVO4/0.1 mg/ml BSA）。测定在环境温度下孵育 1 小时。添加 10 mL 含有 50 mM EDTA、500 mM KF、0.5 mg/ml BSA、5 mg/mL Eu3+ 穴状化合物标记的抗磷酸酪氨酸抗体 Mab PT66-K 和 5 mg/mL 链霉亲和素的检测溶液终止反应-XLent。将反应物孵育半小时，然后在 Analyst GT 上读取荧光信号。细胞测定：将细胞（表达荧光素酶的 Karpas-299、SU-DHL-1 和 Ba/F3 细胞以及稳定表达 NPM-ALK、Bcr-Abl 或 TEL-激酶融合构建体的转化 Ba/F3）接种于 384-孔板（每孔 2.5×104 个细胞）并与连续稀释的 TAE684 或 DMSO 一起孵育 2-3 天。荧光素酶表达用作细胞增殖/存活的衡量标准，并使用 Bright-Glo 荧光素酶测定系统进行评估。 IC50 值是使用 XLFit 软件生成的。

在 Karpas-299 中，用 3 和 10 mg/kg 的 TAE684 治疗 4 周后，淋巴瘤的发展显着延迟，发光信号减少 100 至 1,000 倍，而没有任何化合物或疾病相关毒性的迹象淋巴瘤模型。 TAE684 治疗还可诱导已确诊的 Karpas-299 淋巴瘤的疾病消退并下调 CD30 表达。 TAE684 还对 H3122 CR 异种移植肿瘤表现出令人印象深刻的抗肿瘤活性。此外，TAE684 治疗改善了两种 ALK 突变体的粗糙眼部表型，尤其是 ALKR1275Q 的情况，而克唑替尼对任一表型几乎没有影响。

作为储备溶液，将 10 mM GSK1904529A 溶解在 DMSO 中。 IC50 使用谷胱甘肽 S-转移酶标记的蛋白质测定，这些蛋白质由细菌表达，编码 IGF-1R（氨基酸 957-1367）和 IR（氨基酸 979-1382）的胞内结构域。为了激活激酶，酶必须在 50 mM HEPES (pH 7.5)、10 mM MgCl2、0.1 mg/mL 牛血清白蛋白和 2 mM ATP 中预孵育，终浓度为 2.7 μM。测定板中填充有 100 nL/孔的稀释 GSK1904529A，该 GSK1904529A 已在 DMSO 中稀释。存在的激酶反应物（10 μL）：0.5 nM 活化酶、500 nM 底物肽（生物素-氨基己基AEEEEYMMMMMAKKKK-NH2；QPC）、3 mM DTT、0.1 mg/mL 牛血清白蛋白、1 mM CHAPS、10 mM MgCl2 和10 μM ATP。室温下一小时后，使用 33 μM EDTA 终止反应。使用 1 nM 铕缀合磷酸酪氨酸抗体和 7 nM 链霉亲和素 Surelight 别藻蓝蛋白，时间分辨荧光共振能量转移用于测量肽的磷酸化。多标签阅读器用于读取板。

在 384 孔板中，每孔接种 2.5×10⁴ 细胞，然后用 TAE684 或 DMSO 系列稀释液孵育两到三天。 Bright-Glo 荧光素酶检测系统用于测量荧光素酶表达，这是细胞增殖和存活的指标。要生成 IC50 值，请使用 XLFit 软件。

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细胞增殖试验。[1]
将表达萤光素酶的Karpas-299、SU-DHL-1和Ba/F3细胞以及转化的稳定表达NPM-ALK、BCR-ABL或TEL激酶融合构建体铺在384孔板（每孔25000个细胞）中，并与连续稀释的TAE684或DMSO一起孵育2-3天。萤光素酶表达被用作细胞增殖/存活的指标，并用Bright Glo萤光素酶检测系统进行评估。使用XLFit软件生成IC50值。

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流式细胞术。[1]
Ba/F3-NPM-ALK、Karpas-299和SU-DHL-1细胞用DMSO或不同浓度的TAE684处理24、48和72小时，然后通过流式细胞术分析细胞周期分布和凋亡。在Becton Dickinson LSRII流式细胞仪上分析样本。

In order to conduct in vivo compound efficacy studies, female Fox Chase SCIDBeige mice are injected with 1×10⁶ Karpas-299-, Ba/F3 NPM-ALK-, or BCR-ABL-expressing cells via the tail vein 72 hours later. TAE684 resuspended in 10% 1-methyl-2-pyrrolidinone/90% PEG 300 solution is given to mice (n = 10 per group) at 1, 3, and 10 mg/kg once daily for three weeks, or the vehicle solution is given at the same dosing schedule. Bioluminescence imaging is used once a week to track the progression of the disease and the effectiveness of the compound. The disease is confirmed to be widespread by bioluminescence imaging on day 12, at which point dosing is started in order to assess the effectiveness of TAE684 on established disease. For three days, mice with established lymphomas are given either vehicle solution or TAE684 (10 mg/kg) in order to analyze the downstream molecular effects in vivo. Upon completion of therapy, lymph nodes are removed from the mice and subjected to immunoblotting and histological examination.

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In Vivo Experiments.[1]
For in vivo compound efficacy studies, treatment was initiated 72 h after tail vein injection of 1 × 106 Karpas-299-, Ba/F3 NPM-ALK- or BCR-ABL-expressing cells into female Fox Chase SCIDBeige mice. Mice (n = 10 per group) were administered either TAE684 resuspended in 10% 1-methyl-2-pyrrolidinone/90% PEG 300 solution at 1, 3, and 10 mg/kg once daily for 3 weeks or the vehicle solution at the same dosing schedule. Disease progression and compound efficacy was monitored weekly with bioluminescence imaging. To determine the efficacy of TAE684 on established disease, dosing was initiated on day 12, at which time the disease confirmed to be widespread by bioluminescence imaging. For analysis of downstream molecular effects in vivo, mice with established lymphomas were administered vehicle solution or TAE684 (10 mg/kg) for 3 days. At the end of treatment, mice were killed, and lymph nodes were extracted for immunoblotting and histological analysis.

[1]. Identification of NVP-TAE684, a potent, selective, and efficacious inhibitor of NPM-ALK. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Jan 2;104(1):270-5.

[2]. Therapeutic strategies to overcome PF-02341066 resistance in non-small cell lung cancers harboring the fusion oncogene EML4-ALK. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 May 3;108(18):7535-40.

[3]. Activating ALK mutations found in neuroblastoma are inhibited by PF-02341066 and NVP-TAE684. Biochem J. 2011 Dec 15;440(3):405-13.

5-chloro-N2-[2-methoxy-4-[4-(4-methyl-1-piperazinyl)-1-piperidinyl]phenyl]-N4-(2-propan-2-ylsulfonylphenyl)pyrimidine-2,4-diamine is a member of piperidines.
ALK Inhibitor TAE684 is a small molecule inhibitor of the receptor tyrosine kinases (RTKs) anaplastic lymphoma kinase (ALK) and nucleophosmin-anaplastic lymphoma kinase (NPM-ALK), with potential antineoplastic activity. Upon administration, TAE684 binds to and inhibits ALK and NPM-ALK tyrosine kinases, which leads to a disruption of ALK- and NPM-ALK mediated signaling and eventually inhibits tumor cell growth in ALK- and NPM-ALK overexpressing tumor cells. ALK belongs to the insulin receptor superfamily and plays an important role in nervous system development. ALK dysregulation and gene rearrangements are associated with a series of tumors. NPM-ALK is an oncogenic fusion protein associated with ALK-positive anaplastic large cell lymphoma. ALK mutations are also associated with acquired resistance to small molecule tyrosine kinase inhibitors.

C30H40CLN7O3S

614.2

613.26

C, 58.66; H, 6.56; Cl, 5.77; N, 15.96; O, 7.81; S, 5.22

761439-42-3

16038120

Pale yellow solid powder

1.3±0.1 g/cm3

791.0±70.0 °C at 760 mmHg

432.2±35.7 °C

0.0±2.8 mmHg at 25°C

1.622

2.71

111.31

2

10

9

42

940

0

ClC1=C([H])N=C(N=C1N([H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1S(C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])(=O)=O)N([H])C1C([H])=C([H])C(=C([H])C=1OC([H])([H])[H])N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])(C([H])([H])C1([H])[H])N1C([H])([H])C([H])([H])N(C([H])([H])[H])C([H])([H])C1([H])[H]

QQWUGDVOUVUTOY-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C30H40ClN7O3S/c1-21(2)42(39,40)28-8-6-5-7-26(28)33-29-24(31)20-32-30(35-29)34-25-10-9-23(19-27(25)41-4)37-13-11-22(12-14-37)38-17-15-36(3)16-18-38/h5-10,19-22H,11-18H2,1-4H3,(H2,32,33,34,35)

5-chloro-2-N-[2-methoxy-4-[4-(4-methylpiperazin-1-yl)piperidin-1-yl]phenyl]-4-N-(2-propan-2-ylsulfonylphenyl)pyrimidine-2,4-diamine

NVP-TAE684; TAE 684; TAE684; NVP-TAE 684; 5-chloro-N4-(2-(isopropylsulfonyl)phenyl)-N2-(2-methoxy-4-(4-(4-methylpiperazin-1-yl)piperidin-1-yl)phenyl)pyrimidine-2,4-diamine; TAE684 (NVP-TAE684); NVP-TAE-684; TAE-684

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 0.77 mg/mL (1.25 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 7.7 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 0.77 mg/mL (1.25 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 7.7 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入 900 μL 20% SBE-β-CD 生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: 30% PEG400+0.5% Tween80+5% propylene glycol, pH 4: 10mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。