SHP2 (IC50 = 70 nM)

体外活性：SHP099 与 SHP2 复合物的 X 射线共晶揭示了与受体的碱性胺和 Phe113 主链羰基的新相互作用。 SHP099 在 KYSE-520 模型中显示出对细胞增殖的抑制作用，IC50 为 1.4 μM。 SHP099 在 Caco-2 细胞中表现出高溶解度和高渗透性，没有明显的外排。 SHP099 同时结合 N 端 SH2、C 端 SH2 和蛋白酪氨酸磷酸酶结构域的界面，从而通过变构机制抑制 SHP2 活性。 SHP099 抑制 RAS-ERK 信号传导，从而抑制受体酪氨酸激酶驱动的人类癌细胞的增殖。激酶测定：生化测定。 SHP2 通过双酪氨酰磷酸化肽与其 Src 同源 2 (SH2) 结构域结合而被变构激活。后一个激活步骤导致 SHP2 自抑制界面的释放，从而使 SHP2 PTP 具有活性并可用于底物识别和反应催化。使用替代底物 DiFMUP 以即时荧光测定形式监测 SHP2 的催化活性。更具体地说，磷酸酶反应在室温下在 384 孔黑色聚苯乙烯板、平底、低凸缘、非结合表面（康宁，目录号 3575）中进行，最终反应体积为 25 μL，并采用以下测定缓冲液条件：60 mM HEPES，pH 7.2，75 mM NaCl，75 mM KCl，1 mM EDTA，0.05% P-20，5 mM DTT。使用一种测定法监测测试化合物（浓度范围为 0.003 – 100 μM）对 SHP2 的抑制，其中 0.5 nM 的 SHP2 与 0.5 μM 的肽 IRS1_pY1172(dPEG8)pY1222（序列：H2NLN(pY)IDLDLV( dPEG8)LST(pY)ASINFQK-酰胺)。在 25 oC 下孵育 30-60 分钟后，将替代底物 DiFMUP（Invitrogen，目录号 D6567，200 μM）添加到反应中，并在 25 oC 下孵育 30 分钟（2-593 为 200 μM，1-593 为 100 μM）。 525 构造）。然后通过添加 5 μL 160 μM bpV(Phen) 溶液（Enzo Life Sciences 目录号 ALX-270-204）猝灭反应。使用酶标仪（Envision，Perki-Elmer）监测荧光信号，激发波长和发射波长分别为 340 nm 和 450 nm。使用归一化IC50回归曲线拟合与基于对照的归一化来分析抑制剂剂量反应曲线。细胞测定：使用 AlphaScreen® SureFire™ Phospho-ERK 1/2 试剂盒 (PerkinElmer) 进行 p-ERK 细胞测定：KYSE-520 细胞（30,000 个细胞/孔）在 96 孔板培养物中生长过夜，并在 30 ℃下用 SHP2 抑制剂处理。浓度为 20、6.6、2.2、0.74、0.24、0.08、0.027 μM，37 °C 2 小时。通过添加由 SureFire 磷酸细胞外信号调节激酶 (p-ERK) 测定试剂盒 (PerkinElmer) 提供的 30 μL 裂解缓冲液 (PerkinElmer) 终止孵育。样品根据制造商的指示进行处理。使用 2101 多标记读数器 (Perkin Elmer Envision) 重复测量 p-ERK 的荧光信号。抑制百分比通过总 ERK 信号标准化并与 DMSO 载体对照进行比较。

SHP099 在异种移植模型中表现出剂量依赖性的肿瘤生长抑制作用。单剂量 30 和 100 mg/kg 后，在异种移植物中观察到药效标记物 p-ERK 的剂量依赖性暴露和调节。每日口服剂量 10 或 30 mg/kg 分别可抑制 19% 和 61% 的肿瘤生长。 100 mg/kg 即可实现肿瘤停滞。所有动物研究均根据诺华实验动物护理和使用指南进行。将雌性裸鼠皮下接种（3 x 106 个细胞）于汉克平衡盐溶液中含有 50% 无酚红基质胶（BD Biosciences）的悬浮液中，并与亲本 KYSE-520 细胞一起接种。对于 PK/PD 研究，一旦肿瘤达到大约 500 mm3，小鼠就被给予单剂量的载体对照或通过口服强饲法给予 1 剂。随后在单剂量化合物后的预定时间点对小鼠实施安乐死，此时收集血浆和异种移植物碎片分别用于测定1浓度和p-ERK调节。为了进行功效研究，每周两次对小鼠进行二维测径。一旦肿瘤达到大约 200 mm3，小鼠就被随机分配到治疗组。对于功效研究，小鼠被分配接受媒介物1（10、30或100 mg/kg，每日一次）或厄洛替尼（80 mg/kg，每日一次）口服灌胃。每周两次评估肿瘤体积和小鼠体重。为了评估异种移植蛋白裂解物中的 MAPK 途径调节，使用市售试剂盒（Meso Scale Discovery 目录号 K15107D）评估了总 ERK1/2 和磷酸 ERK1/2。该测定按照 Meso Scale Discovery 的建议进行，不同之处在于蛋白质裂解物需要孵育过夜。

双酪氨酰磷酸化肽与 SHP2 的 Src 同源 2 (SH2) 结构域的结合会导致蛋白质的变构激活。在后一个激活步骤中，SHP2 的自抑制界面的释放使 SHP2 PTP 具有活性，并为底物识别和反应催化做好准备。在即时荧光测定形式中，通过使用替代底物 DiFMUP 观察 SHP2 的催化活性。更具体地说，使用 25 μL 的最终反应体积和以下测定缓冲液条件：60 mM HEPES、pH 7.2、75 mM NaCl、75 mM KCl、1 mM EDTA、0.05% P-20 和 5 mM DTT（磷酸酶）反应在室温下在 384 孔黑色聚苯乙烯板、平底、低凸缘、非结合表面（Corning，目录号 3575）中进行。用于测量测试化合物（浓度范围为 0.003 至 100 μM）对 SHP2 的抑制作用的测定涉及将 0.5 nM SHP2 与 0.5 μM 肽 IRS1_pY1172(dPEG8)pY1222（序列：H2NLN(pY)IDLDLV(dPEG8) 一起孵育)LST(pY)ASINFQK-酰胺)。在 25 oC 下孵育 30 至 60 分钟后，向反应中添加替代底物 DiFMUP（Invitrogen，目录号 D6567，200 μM），并在 25 oC 下进一步孵育 30 分钟（2-593 为 200 μM， 1-525 构建体为 100 μM）。随后，添加 5 μL 160 μM bpV(Phen) 溶液（Enzo Life Sciences 目录号 ALX-270-204）以淬灭反应。分别使用 340 nm 和 450 nm 的激发和发射波长，使用酶标仪（Envision，Perki-Elmer）监测荧光信号。使用基于对照的归一化拟合的归一化 IC50 回归曲线来分析抑制剂剂量反应曲线。

使用 PerkinElmer 的 AlphaScreen® SureFireTM Phospho-ERK 1/2 试剂盒进行 p-ERK 细胞测定：在 96 孔板培养物中生长整夜后，KYSE-520 细胞（30,000 个细胞/孔）用 SHP2 抑制剂处理两小时37 °C，浓度为 20、6.6、2.2、0.74、0.24、0.08 和 0.027 μM。添加 30 微升裂解缓冲液 (PerkinElmer)（随 SureFire 磷酸细胞外信号调节激酶 (p-ERK) 测定试剂盒 (PerkinElmer) 提供）以结束孵育。样品按照制造商的说明进行处理。使用 Perkin Elmer Envision 2101 多标记读数器对 p-ERK 荧光信号进行两次测量。整个 ERK 信号用于标准化抑制百分比，然后与 DMSO 载体对照进行对比。

[1]. J Med Chem . 2016 Sep 8;59(17):7773-82.

[2]. Nature . 2016 Jul 7;535(7610):148-52.

[3]. Leukemia . 2018 May;32(5):1246-1249.

C16H19CL2N5

352.26

351.101

C, 54.55; H, 5.44; Cl, 20.13; N, 19.88

1801747-42-1

SHP099 monohydrochloride;2200214-93-1;SHP099 hydrochloride;1801747-11-4

118238298

Light yellow to yellow solid powder

1.3±0.1 g/cm3

530.4±50.0 °C at 760 mmHg

274.5±30.1 °C

0.0±1.4 mmHg at 25°C

1.626

3.97

81.1Ų

2

5

2

23

402

0

ClC1C(=C([H])C([H])=C([H])C=1C1C(N([H])[H])=NC(=C([H])N=1)N1C([H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])C1([H])[H])N([H])[H])Cl

YGUFCDOEKKVKJK-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C16H19Cl2N5/c1-16(20)5-7-23(8-6-16)12-9-21-14(15(19)22-12)10-3-2-4-11(17)13(10)18/h2-4,9H,5-8,20H2,1H3,(H2,19,22)

6-(4-amino-4-methylpiperidin-1-yl)-3-(2,3-dichlorophenyl)pyrazin-2-amine

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1.2 mg/mL (3.41 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 12.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 1.2 mg/mL (3.41 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 12.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 1.2 mg/mL (3.41 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 12.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: ≥ 0.67 mg/mL (1.90 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 5 中的溶解度: ≥ 0.67 mg/mL (1.90 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 95% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 6 中的溶解度: ≥ 0.13 mg/mL (0.37 mM) (饱和度未知) in 1% DMSO 99% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 7 中的溶解度: 10 mg/mL (28.39 mM) in 0.5% CMC-Na/saline water (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。