WT TRKA (IC50 = 0.6 nM); TRKA G595R (IC50 = 2 nM); TRKC G623R (IC50 = 2.3 nM); WT TRKC (IC50 = 2.5 nM); TRKC G696A (IC50 = 2.5 nM)

体外活性：LOXO-195 是第二代强效选择性 TRK TKI（酪氨酸激酶抑制剂），旨在克服在多个对其他 TRK 产生耐药性的患者中发现的由复发性激酶结构域（溶剂前沿和 xDFG）突变介导的获得性耐药TKI，例如拉罗替尼 (LOXO-101)。 TRKA 和 TRKC 的 IC50 分别为 0.6±0.1 nM，<2.5 nM。针对获得性突变的活性在基于酶和细胞的测定以及体内肿瘤模型中得到证实。作为概念的临床证明，对 larotrectinib 产生获得性耐药突变的前 2 名 TRK 融合阳性癌症患者首次在人体上接受了 LOXO-195 治疗，采用药代动力学评估指导下的快速剂量滴定。这种方法导致了快速的肿瘤反应，并延长了两名患者通过 TRK 抑制实现的疾病控制的总体持续时间。 LOXO-195 消除了获得激酶结构域突变的 TRK 融合阳性癌症的耐药性，这是所有现有 TRK TKI 的共同责任。这通过证明持续的 TRK 依赖性确立了序贯治疗的作用，并验证了针对已验证的致癌靶点加速开发下一代抑制剂的范例。激酶测定：使用 LanthaScreen™ Eu 激酶结合技术 测量每个纯化 TRK 激酶结构域的结合亲和力。简而言之，将每种供体铕抗体标记的重组TRK激酶结构域与Fluor 236探针和每种抑制剂的系列稀释液一起温育，并通过TR-FRET监测添加的抑制剂对探针结合的影响。在每种化合物的系列稀释液存在下，通过监测[γ-33P]-ATP 中的[33P]PO4 掺入聚-EAY 肽底物来测定酶活性。使用 KinaseProfiler™ 进行激酶分析。有关更多详细信息，请参阅补充方法。细胞测定：KM12细胞于2011年从NCI-Frederick Cancer DCTD肿瘤细胞存储库获得。CUTO-3细胞于2015年从科罗拉多大学癌症中心的Robert Doebele博士获得。MO-91细胞从Stephen博士获得Nimer，迈阿密大学西尔维斯特癌症中心，2015年。2015年从Eurofins OncoPanel细胞系集合 中选出84个NTRK基因重排阴性人类癌细胞系。NIH 3T3细胞由Array BioPharma于2007-2016年获得。 Eurofins 细胞系通过短串联重复序列 (STR) 分析进行验证。 KM12、CUTO-3 和 MO-91 细胞通过 Oncomine Focus Assay NGS 测定 确认每种融合体（例如分别为 TPM3-NTRK1、ETV6-NTRK3 或 MPRIP-NTRK1）的存在来进行验证。 ，实验后 12 个月内）。表达 ΔTRKA 和 ETV6-TRKC 变体的 NIH 3T3 细胞按照补充方法中所述进行工程改造。对于细胞磷酸化TRK测量，将细胞接种到96孔板中并在37°C下孵育过夜，与每种抑制剂的稀释系列一起孵育一小时，然后原位裂解每个孔单层并通过以下方法定量磷酸化TRKA水平：按照制造商的说明进行 ELISA 测定。对于细胞磷酸化 ERK 评估，将表达每种 FLAG 标记的 ETV6-TRKC 变体的细胞接种到 96 孔板中，用每种抑制剂处理一小时，然后进行甲醛固定、基于皂苷的悬浮液/透化、与磷酸化 ERK 抗体一起孵育、APC-抗-FLAG 和 PE 抗兔二抗以及流式细胞术分析。

所有动物研究均按照 1996 年实验动物护理和使用指南 (NRC) 和 AAALAC-International 进行。将每种细胞系（2–5×10e6 个细胞）皮下注射到 7–9 周龄的雌性 nu/nu NCr 小鼠（Taconic，奥尔巴尼，纽约州）中，并使其生长至约 100–200 mm3（功效）或约 500mm3（功效）。 PK-PD）之前根据肿瘤大小进行随机化并通过口服强饲法使用每种抑制剂进行治疗。对于 PK-PD 分析，动物给药 3 天，然后安乐死、切除肿瘤并收集血浆。通过 ELISA 测定测定肿瘤裂解物中的磷酸化-TRK 水平，通过 LC-MS/MS 测定血浆抑制剂水平。为了进行功效分析，通过口服管饲给动物给药，并定期监测体重和肿瘤大小。有关更多详细信息，请参阅补充方法。

LanthaScreenTM Eu 激酶结合技术 用于测量每个纯化 TRK 激酶结构域的结合亲和力。总之，将每个供体铕抗体标记的重组 TRK 激酶结构域与 Fluor 236 探针和每种抑制剂的系列稀释液一起孵育。 TR-FRET 用于追踪添加的抑制剂对探针结合的影响。将 [γ-33P]-ATP 中的 [33P]PO4 掺入聚 EAY 肽底物中，同时连续稀释每种化合物，从而可以测定酶活性。使用KinaseProfilerTM 进行激酶分析。要了解更多信息，请参阅补充方法。

根据标准方案收获细胞、计数并以 3×10⁴ 细胞/孔（野生型细胞系）或5×10⁴ 细胞/孔（突变细胞系），100 μL/孔含有 10% FBS 的 DMEM 生长培养基。该过程可以评估细胞抑制效力。之后，将板在室温下孵育 30 分钟，然后在 37°C 和 5% CO₂ 下再孵育一晚。之后，用 TRK 抑制剂物质（例如 selitrectinib (LOXO-195)）在 37°C 和 5% CO₂ 下处理细胞一小时。对照孔中存在 1 微克 larotrectinib 或 LOXO-195，或单独的 0.25% DMSO。化合物孵育后，除去生长培养基，并向每孔中添加 60 μL 含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的冰冷裂解缓冲液以裂解细胞[1]。

Mice: Female nu/nu NCr mice are given subcutaneous injections of KM12 cells (5x10⁶ cells) and the NIH-3T3 tumor cell lines (~2-3x10⁶ cells) in the right flank. Animals are randomized by tumor size into dosing groups of 5 (KM12), 7 (NIH 3T3 ΔTRKA variants), or 3–4 (for PK-PD) animals. Tumors are allowed to grow to approximately 100–200 mm³ or 500 mm³. The medication is administered orally to the animals using either larotrectinib in 100% Labrafac lipophile or selitrectinib (LOXO-195) in 1% carboxymethylcellulose/0.5% Tween-80 as the vehicle. All animals are acquired between 6 and 8 weeks of age, kept in groups of 5, and given a week to acclimate before being injected with cancer cells. For nine to twelve days, animals are given the following dosages: vehicle twice daily, 30 mg/kg, 100 mg/kg, and 300 mg/kg of selitrectinib (LOXO-195) twice daily, and 60 mg/kg of larotrectinib per day. Following cell implantation and at regular intervals throughout dosage, body weight and tumor size are observed[1].

[1]. A Next-Generation TRK Kinase Inhibitor Overcomes Acquired Resistance to Prior TRK Kinase Inhibition in Patients with TRK Fusion-Positive Solid Tumors. Cancer Discov. 2017 Sep;7(9):963-972.

Selitrectinib is under investigation in clinical trial NCT03215511 (Phase 1/2 Study of LOXO-195 in Patients With Previously Treated NTRK Fusion Cancers).
Selitrectinib is an orally bioavailable, selective tropomyosin-related-kinase (tyrosine receptor kinase; TRK) inhibitor, with potential antineoplastic activity. Upon oral administration, LOXO-195 specifically targets and binds to TRK, including the fusion proteins containing sequences from neurotrophic tyrosine receptor kinase (NTRK) types 1 (NTRK1), 2 (NTRK2), and 3 (NTRK3). This prevents neurotrophin-TRK interaction and TRK activation, which results in both the induction of cellular apoptosis and the inhibition of cell growth in tumors that overexpress TRK and/or express NTRK fusion proteins. LOXO-195 targets specific point mutations that occur after treatment with and result in acquired resistance to another TRK inhibitor; therefore, LOXO-195 is able to overcome acquired resistance to other TRK inhibitors. TRK, a family of receptor tyrosine kinases (RTKs) activated by neurotrophins, is encoded by NTRK family genes. The expression of either mutated forms of or fusion proteins involving NTRK family members results in uncontrolled TRK signaling and plays an important role in tumor cell growth and survival.

C20H21FN6O

380.43

380.176

C, 63.14; H, 5.56; F, 4.99; N, 22.09; O, 4.21

2097002-61-2

(3aR)-Selitrectinib;1350884-56-8; 2097002-61-2; 2097002-59-8 (RS-isomer)

129103609

White to yellow solid powder

1.5±0.1 g/cm3

1.751

2.27

75.4

1

6

0

28

593

2

FC1C([H])=NC2C([H])([H])C([H])([H])[C@@]([H])(C([H])([H])[H])N([H])C(C3C([H])=NN4C([H])=C([H])C(=NC4=3)N3C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@]3([H])C=2C=1[H])=O

OEBIHOVSAMBXIB-SJKOYZFVSA-N

InChI=1S/C20H21FN6O/c1-12-4-5-16-14(9-13(21)10-22-16)17-3-2-7-26(17)18-6-8-27-19(25-18)15(11-23-27)20(28)24-12/h6,8-12,17H,2-5,7H2,1H3,(H,24,28)/t12-,17-/m1/s1

(6R,15R)-9-fluoro-15-methyl-2,11,16,20,21,24-hexazapentacyclo[16.5.2.02,6.07,12.021,25]pentacosa-1(24),7(12),8,10,18(25),19,22-heptaen-17-one

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.47 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.47 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.47 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。