SCH772984

ERK2 (IC50 = 1 nM); ERK1 (IC50 = 4 nM)

SCH772984 是一种新型、选择性、ATP 竞争性 ERK1/2 抑制剂。 SCH772984 以剂量依赖性方式抑制 p90 核糖体 S6 激酶（一种 ERK 底物）的磷酸化（T359/S363 磷酸-RSK）。此外，SCH772984 还可抑制 ERK 自身激活环残基的磷酸化。 SCH772984 在大约 88% 和 49% 的 BRAF 突变或 RAS 突变肿瘤系中分别表现出 <500 nM 的 EC50 值。重要的是，SCH772984 成功抑制了对 BRAF 和 MEK 抑制剂同时治疗有抗性的肿瘤细胞中的 MAPK 信号传导和细胞增殖。 [1]

SCH772984 在耐受剂量下可诱导异种移植模型中的肿瘤消退。在对 BRAF 或 MEK 抑制剂耐药的模型中，SCH772984 成功抑制 MAPK 信号传导和细胞增殖。 [1]

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SCH772984在LPS诱导的小鼠中升高血糖，增加G6Pase和PEPCK的表达，并抑制pERK1/2和pFoxo1的表达。[2]

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在从人黑色素瘤或胰腺癌细胞系建立的BRAF或KRAS突变异种移植物模型中评估了SCH772984的体内抗肿瘤疗效。用SCH772984（50mg/kg，每日两次）治疗BRAF突变LOX黑色素瘤异种移植物导致98%的肿瘤消退（图2B）。在KRAS突变胰腺MiaPaCa模型中也观察到剂量依赖性的抗肿瘤活性，在50mg/kg每日两次的剂量下，抑制率为36%（图2C）。重要的是，肿瘤消退伴随着肿瘤组织中ERK磷酸化的强烈抑制（图2D）。根据发病率、致死率或体重减轻来衡量，SCH772984在这个时间表上具有良好的耐受性（图2E）。[1]

ERK2-IMAP酶法测定[1]
SCH772984在8点稀释曲线中针对纯化的ERK1或ERK2进行了两次测试。将酶加入反应板中，与化合物一起孵育，然后加入底物肽和ATP的溶液。将14微升稀释的酶（每个反应0.3ng活性ERK2）加入384孔板的每个孔中。轻轻摇动平板以混合试剂，并在室温下孵育45分钟。用60μL IMAP结合溶液（1×结合缓冲液中1:2200稀释的IMAP珠）停止反应。将平板在室温下再孵育0.5小时，以使磷酸肽与IMAP珠完全结合。在LJL Analyst上读取Plate。

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Kinase Panel Screening/激酶筛查[1]
在CRO公司的310激酶面板上评估了SCH772984的激酶抑制谱。

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TdF测定[1]
在含有终浓度为5×Sypro Orange报告染料的TdF测定缓冲液（10 mmol/L HEPES pH 7.4，150 mmol/L NaCl，5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L DTT）中，以终浓度为0.5μmol/L的浓度对大鼠ERK2、大鼠磷酸化ERK2和人MEK1蛋白进行解折叠。样品中含有10、5或2.5μmol/L的化合物，DMSO的最终浓度为2%。样品在5μL的白色384孔实时PCR板中运行。用透明密封膜密封板，并在LightCycler 480-II中进行测定。温度在15分钟内从23°C升至99°C。荧光强度以每度15个数据点收集，激发波长为465 nm，发射波长为580 nm。

细胞以每孔 4,000 个的密度铺板，进行 96 孔细胞增殖实验（六次重复）。细胞接种后 24 小时，用 DMSO 或最终浓度为 1% DMSO 的 9 点 IC50 稀释液 (0.001-10 μM) 处理所有浓度的细胞。给药五天后，按照制造商的说明，使用 ViaLight 发光试剂盒评估活力。 CellTiterGlo 发光细胞活力测定用于测量细胞系经 SCH772984 处理 4 天后的活力。

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细胞增殖实验以96孔的形式进行（六次重复），细胞以每孔4000个细胞的密度铺板。在细胞接种后24小时，用DMSO或9点IC50稀释液（0.001-10μmol/L）处理细胞，终浓度为1%DMSO。根据制造商的建议，在给药后5天使用ViaLight发光试剂盒测定存活率（n=6，平均值±SE）。对于细胞系面板存活率测定，用SCH772984处理细胞4天，并通过CellTiterGlo发光细胞存活率测定法进行测定。对于IncuCyte分析，如上所述将细胞铺在96孔板中，并在活体生长过程中每2小时收集一次基于图像的细胞融合数据。对于工程抗性系，细胞被慢病毒感染，慢病毒由慢ORF构建体（pLOC载体）产生，表达RFP、KRASG13D、BRAFV600E、缺少外显子2-8（Δ2-8）的截短BRAFV600E、MEK1P124L、MEK1F129L或组成型活性MEK1DD（S218D+S222D）。如上所述，在杀芽素（20μg/mL）中选择细胞并用于ViaLight测定。

Nude mice
12.5 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg
i.p.

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Xenograft Tumor Growth Assay[1]
Nude mice were injected subcutaneously with specific cell lines, grown to approximately 100 mm3, randomized to treatment groups (10 mice/group), and treated intraperitoneally with either SCH772984 or vehicle according to the dosing schedule indicated in the figure legends. Tumor length (L), width (W), and height (H) were measured during and after the treatment periods by a caliper twice weekly on each mouse and then used to calculate tumor volume using the formula (L × W × H)/2. Animal body weights were measured on the same days twice weekly. Data were expressed as mean ± SEM. Upon completion of the experiment, vehicle- and SCH772984-treated tumor biopsies were processed for Western blot analysis.[1]

[1]. Discovery of a novel ERK inhibitor with activity in models of acquired resistance to BRAF and MEK inhibitors. Cancer Discov. 2013 Jul;3(7):742-50.

SCH772984 is a member of the class of indazoles that is 1H-indazole substituted by pyridin-4-yl and {[(3R)-1-(2-oxo-2-{4-[4-(pyrimidin-2-yl)phenyl]piperazin-1-yl}ethyl)pyrrolidin-3-yl]carbonyl}amino groups at positions 3 and 5, respectively. It is a potent inhibitor of mitogen-activated protein kinases ERK1 and ERK2 (IC50 = 4 and 1 nM, respectively) that exhibits anti-cancer properties. It has a role as an antineoplastic agent, an EC 2.7.11.24 (mitogen-activated protein kinase) inhibitor, an apoptosis inducer and an analgesic. It is a member of pyridines, a biaryl, a secondary carboxamide, a pyrrolidinecarboxamide, a member of indazoles, a tertiary amino compound, a N-acylpiperazine, a N-arylpiperazine, a member of pyrimidines, a N-alkylpyrrolidine and a tertiary carboxamide.

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The high frequency of activating RAS or BRAF mutations in cancer provides strong rationale for targeting the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway. Selective BRAF and MAP-ERK kinase (MEK) inhibitors have shown clinical efficacy in patients with melanoma. However, the majority of responses are transient, and resistance is often associated with pathway reactivation of the extracellular signal-regulated kinase (ERK) signaling pathway. Here, we describe the identification and characterization of SCH772984, a novel and selective inhibitor of ERK1/2 that displays behaviors of both type I and type II kinase inhibitors. SCH772984 has nanomolar cellular potency in tumor cells with mutations in BRAF, NRAS, or KRAS and induces tumor regressions in xenograft models at tolerated doses. Importantly, SCH772984 effectively inhibited MAPK signaling and cell proliferation in BRAF or MEK inhibitor-resistant models as well as in tumor cells resistant to concurrent treatment with BRAF and MEK inhibitors. These data support the clinical development of ERK inhibitors for tumors refractory to MAPK inhibitors.[1]

C33H33N9O2

587.67

587.275

C, 67.44; H, 5.66; N, 21.45; O, 5.44

942183-80-4

24866313

Yellow Solid powder

1.4±0.1 g/cm3

857.3±65.0 °C at 760 mmHg

472.3±34.3 °C

0.0±3.2 mmHg at 25°C

1.694

2.1

126.73

2

8

7

44

957

1

N(C1C=CC2=C(C(C3C=CN=CC=3)=NN2)C=1)C([C@@H]1CCN(CC(N2CCN(C3C=CC(C4N=CC=CN=4)=CC=3)CC2)=O)C1)=O

HDAJDNHIBCDLQF-RUZDIDTESA-N

InChI=1S/C33H33N9O2/c43-30(42-18-16-41(17-19-42)27-5-2-24(3-6-27)32-35-11-1-12-36-32)22-40-15-10-25(21-40)33(44)37-26-4-7-29-28(20-26)31(39-38-29)23-8-13-34-14-9-23/h1-9,11-14,20,25H,10,15-19,21-22H2,(H,37,44)(H,38,39)/t25-/m1/s1

(3R)-1-[2-oxo-2-[4-(4-pyrimidin-2-ylphenyl)piperazin-1-yl]ethyl]-N-(3-pyridin-4-yl-1H-indazol-5-yl)pyrrolidine-3-carboxamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.4 mg/mL (4.08 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 1.43 mg/mL (2.43 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 14.3 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: 1.43 mg/mL (2.43 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 14.3 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 4 中的溶解度: ≥ 1.43 mg/mL (2.43 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，您可以将 100 μL 14.3 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 5 中的溶解度： 5% DMSO+30% PEG 300+ddH2O: 0.6mg/mL

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配方 6 中的溶解度: 20 mg/mL (34.03 mM) in 20% SBE-β-CD adjusted to pH 4-4.5 with 1 N acetic (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶.

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。