TGF-β-RI/ALK5 (transforming growth factor-beta receptor I/activin like kinase 5) (4 nM = IC50)

RepSox (GMP) (10 μM) 可诱导 MEF 分化为化学诱导多能干细胞 (CiPSC)[1]。 hCiPS 细胞由 RepSox (GMP)（10 μM，在 I-Stage III 诱导培养基中）从 HEF 诱导而来[2]。 EdU 掺入的增加证实 RepSox (GMP) 加 Forskolin 可以增加表达 MyoD 的 MEF 中增殖细胞的数量 [3]。

当注射到囊胚中时，RepSox 能够在体内有助于形成嵌合胚胎。用 RepSox 进行一天的治疗足以替代转基因 Sox2。

ALK5荧光偏振结合试验。[1]
荧光偏振是一种在文献中有充分记载的方法。与荧光基团结合的激酶抑制剂化合物可以作为荧光配体来监测其他化合物与给定激酶的ATP竞争性结合。平面偏振光去极化的增加是由结合的配体释放到溶液中引起的，用极化/各向异性值来测量。在纯化的重组GST−ALK5（残基198−503）上检测化合物与ALK5的结合。用不同浓度的测试化合物取代罗丹明绿荧光标记的ATP竞争抑制剂24来计算结合pIC50。将GST−ALK5添加到含有62.5 mM Hepes, pH 7.5, 1 mM DTT, 12.5 mM MgCl2, 1.25 mM CHAPS和1 nM罗丹明绿色标记配体的缓冲液中，根据酶的活性位点滴定，最终ALK5浓度为10 nM。将酶/配体试剂40微升加入含有1 μL不同浓度化合物的384孔分析板中。在LJL Acquest荧光仪上立即读取，激发、发射和二向色滤光片分别为485、530和505 nm。Acquest计算每个孔的荧光偏振，然后导入曲线拟合软件，构建浓度-响应曲线。

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ALK5自磷酸化试验。[1]
用PCR方法克隆了ALK5 (Franzen， P. 1993)（氨基酸162−503）的激酶结构域，并在杆状病毒/Sf9细胞系统中表达。该蛋白在C端被6-His标记，并通过Ni2+柱亲和层析纯化，获得的材料用于在自磷酸化实验中评估化合物的活性。纯化酶（10 nM）在50 μL Tris缓冲液中孵育(Tris 50 mM, pH 7.4；NaCl, 100 mM；MgCl2, 5 mM；MnCl2, 5 mM；和DTT， 10毫米)。将酶与不同浓度的化合物（试验中最终浓度为0.1% DMSO）在37℃下预孵育10分钟。然后加入3 μM ATP （0.5 μCi γ-33P-ATP）引发反应。在37°C下加热15分钟后，加入SDS - PAGE样品缓冲液（50 mM Tris-HCl, pH 6.9, 2.5%甘油，1% SDS和5% β-巯基乙醇）停止磷酸化。样品在95°C下煮沸5分钟，在12% SDS - PAGE上运行。干燥的凝胶暴露在荧光屏上过夜。使用Storm成像系统量化ALK5自磷酸化。

测定ALK5抑制剂抗tgf -β活性的细胞实验。[1]
化合物的活性在HepG2细胞中进行了转录试验。用PAI-1启动子驱动荧光素酶（萤火虫）报告基因稳定转染细胞。25与对照条件相比，稳定转染的细胞对TGF-β刺激的荧光素酶活性增加了10 - 20倍。 为检测化合物抗tgf -β活性，将细胞以35000个/孔的浓度接种于96孔微孔板中，接种于200 μL含血清培养基中。然后将微孔板置于37°C， 5% CO2 atm的细胞培养箱中24 h。在加入重组TGF-β (1 ng/mL)之前，将溶解于DMSO中的化合物以50 nM ~ 10 μM的浓度（DMSO的终浓度为1%）加入30min。孵育过夜后，用PBS洗涤细胞，加入10 μL被动裂解缓冲液裂解细胞。荧光素酶活性相对于对照组的抑制作用被用作化合物活性的测量。构建浓度-响应曲线，以图形方式确定IC50值。

[1]. Identification of 1,5-naphthyridine derivatives as a novel series of potent and selective TGF-beta type I receptor inhibitors. J Med Chem. 2004 Aug 26;47(18):4494-506.
[2]. RepSox, a small molecule inhibitor of the TGFβ receptor, induces brown adipogenesis and browning of white adipocytes. Acta Pharmacol Sin. 2019 Dec;40(12):1523-1531.

1,5-naphthyridine, 2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1h-pyrazol-4-yl]- is a pyrazolopyridine.
Optimization of the screening hit 1 led to the identification of novel 1,5-naphthyridine aminothiazole and pyrazole derivatives, which are potent and selective inhibitors of the transforming growth factor-beta type I receptor, ALK5. Compounds 15 and 19, which inhibited ALK5 autophosphorylation with IC50 = 6 and 4 nM, respectively, showed potent activities in both binding and cellular assays and exhibited selectivity over p38 mitogen-activated protein kinase. The X-ray crystal structure of 19 in complex with human ALK5 is described, confirming the binding mode proposed from docking studies.[1]

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Unlike white adipose tissue (WAT), brown adipose tissue (BAT) is mainly responsible for energy expenditure via thermogenesis by uncoupling the respiratory chain. Promoting the differentiation of brown fat precursor cells and the browning of white fat have become a research hotspot for the treatment of obesity and associated metabolic diseases. Several secreted factors and a number of small molecules have been found to promote brown adipogenesis. Here we report that a single small-molecule compound, RepSox, is sufficient to induce adipogenesis from mouse embryonic fibroblasts (MEFs) in fibroblast culture medium. RepSox is an inhibitor of the transforming growth factor-beta receptor I (TGF-β-RI), other inhibitors of TGF-β pathway such as SB431542, LY2157299, A83-01, and Tranilast are also effective in inducing adipogenesis from MEFs. These adipocytes express brown adipocyte-specific transcription factors and thermogenesis genes, and contain a large number of mitochondria and have a high level of mitochondrial respiratory activity. More interestingly, RepSox has also been found to promote the differentiation of the brown fat precursor cells and induce browning of the white fat precursor cells. These findings suggest that inhibitors of TGF-β signaling pathway might be developed as new therapeutics for obesity and type 2 diabetes.[2]

C17H13N5

287.32

287.117

C, 71.06; H, 4.56; N, 24.37

446859-33-2

RepSox;446859-33-2

449054

Light brown to yellow solid powder

1.3±0.1 g/cm3

501.9±50.0 °C at 760 mmHg

195 °C

230.5±23.1 °C

0.0±1.2 mmHg at 25°C

1.692

1.28

67.35

1

4

2

22

376

0

LBPKYPYHDKKRFS-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C17H13N5/c1-11-4-2-5-16(20-11)17-12(10-19-22-17)13-7-8-14-15(21-13)6-3-9-18-14/h2-10H,1H3,(H,19,22)

2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-1,5-naphthyridine

E-616452, SJN 2511; E 616452; 446859-33-2; 2-(3-(6-Methylpyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)-1,5-naphthyridine; ALK5 Inhibitor II; ALK5 Inhibitor; SJN 2511; 2-[5-(6-methylpyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl]-1,5-naphthyridine; C17H13N5; E616452; RepSox; SJN-2511; SJN-2511; ALK5 Inhibitor II

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 7.5 mg/mL (26.10 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 75.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 7.5 mg/mL (26.10 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 75.0mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 1.67 mg/mL (5.81 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 4 中的溶解度: ≥ 1.67 mg/mL (5.81 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 95% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 5 中的溶解度: ≥ 0.33 mg/mL (1.15 mM) (饱和度未知) in 1% DMSO 99% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。