Raltitrexed (ZD1694）   中文名称: 雷替曲塞

thymidylate synthase (IC50 = 9 nM)

体外活性：雷替曲塞诱导浓度依赖性数量的双链 DNA 断裂。在含有 wt p53 的 Lovo 和 LS174T 细胞系中，雷替曲塞可将 Bax 蛋白水平提高至 5 倍。在 HCT-8 细胞系中，雷替曲塞导致细胞内磷酸核糖焦磷酸 (PRPD) 增加，这表明雷替曲塞与 5-FU 联用的细胞毒性作用可能是由于 5-FU 核苷酸形成增加所致。雷替曲塞与 SN-38 联合使用，可在人结肠癌细胞中产生宽剂量效应范围内的协同细胞毒性。雷替曲塞被细胞主动吸收，然后快速、广泛地代谢为一系列聚谷氨酸盐，从而产生有效的胸苷酸合酶抑制作用。雷替曲塞非常快速地递送至大脑，5分钟后即可在所有脑组织中检测到。通过计算组合指数证明，雷替曲塞组合亚叶酸 (5FU-FA) 显示出明显的依赖于时间表的协同抗增殖相互作用。雷替曲塞与伏立诺他联合产生协同效应，同时产生明显的细胞周期扰动和主要的 S 期停滞。雷替曲塞是一种基于叶酸的特异性胸苷酸合成酶抑制剂，其治疗晚期结直肠癌的活性与氟尿嘧啶（5-氟尿嘧啶）加亚叶酸相当。雷替曲塞的活性通过快速细胞进入和多谷氨酸化而增强，多谷氨酸化衍生物的抑制效力比母体化合物高约 100 倍。细胞分析：Raltitrexed (ZD1694) 是一种新型喹唑啉叶酸类似物，可选择性抑制胸苷酸合酶。在细胞内，雷替曲塞被聚谷氨酸化为其活性形式，可以在细胞中长时间保留。雷替曲塞的清除率为110至165 ml/min/m(2)，稳态分布容积超过200 l/m(2)。雷替曲塞的脑脊液渗透性有限（0.6%至2.0%），并且仅在10mg/m(2)剂量后才能在脑脊液中检测到药物。 ZD1694 的体外抗结肠肿瘤活性谱与 5-氟尿嘧啶（用亚叶酸调节）仅部分重叠。 ZD1694 对小鼠具有抗肿瘤活性。 ZD1694进入临床研究并已完成I期和II期评估，在多种肿瘤类型中观察到活性。 II 期结直肠研究中的显着活性（中期分析的客观缓解率为 29%）导致了当前的 III 期研究，随机对照 5-氟尿嘧啶/亚叶酸。

Raltitrexed (0, 5, 10, 11.5, 13.5, 15 mg/kg b/w, ip) 以剂量依赖性方式增加 NTD 小鼠模型的胚胎再吸收率和生长迟缓。 Raltitrexed (11.5 mg/kg b/w) 最大限度地抑制胚胎组织中的胸苷酸合酶 (TS) 活性，降低 dTMP 水平，同时增加 dUMP 水平。

蛋白质印迹分析
将HepG2接种到六孔板中，并根据指定用不同的兴奋剂处理。然后通过离心收获细胞，并使用细胞裂解缓冲液裂解以获得总蛋白。通过Bradford测定试剂盒测定蛋白质浓度。将蛋白质（30µg）加载到10%SDS聚丙烯酰胺凝胶的每个泳道中，并转移到PVDF膜上（Roche，Germany）。将膜在5%（w/v）脱脂奶中封闭1小时，然后在室温下与第一抗体孵育1小时。在TBST中洗涤三次后，将膜与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔IgG（稀释1:5000）在室温下孵育1 h，然后洗涤三次。最后，使用增强化学发光系统ECL（Roche）检测蛋白质的表达水平。免疫印迹条带通过FluorChemFC2成像系统（Alpha Innotech，San Leandro，CA，USA）进行定量，并将感兴趣的蛋白质标准化为β-肌动蛋白。[1]

将 GM00637 细胞以每 25 cm² 烧瓶 3.3×10⁵ 细胞的密度铺板，以评估雷替曲塞对细胞活力和/或生长的影响。 24 小时后，将培养基更换为添加了不同量雷替曲塞的培养基，雷替曲塞的浓度范围很广，从低于 1 nM 到高于 1 µM。对于测试的每个剂量，使用三个细胞烧瓶。暴露于雷替曲塞 24 小时后，将细胞重新注入不含雷替曲塞的培养基中。无药物培养基补加后 48 小时收集细胞并计数。通过将暴露细胞的细胞计数与未暴露于不同剂量的雷替曲塞的对照细胞进行比较来测量雷替曲塞对细胞活力和/或生长速率的影响。

The experiment uses adult C57BL/6 mice weighing 19–20 g at 7-8 weeks of age. Mice are kept at 22°C with a 12-hour light/dark cycle. They are given unlimited access to tap water and regular mouse chow. The male and female mice mate overnight, and the next morning, the vaginal plugs are checked. Gestational day 0.5 is when the vaginal plug is present in the pregnant mice. Six groups of ten pregnant mice each are created at random. On gestational day 7.5, five groups receive intraperitoneal injections of varying doses of Raltitrexed (5, 10, 11.5, 13.5, and 15 mg/kg b/w). Raltitrexed is dissolved in 0.99% NaCl. On day 7.5 of gestation, the control group receives an intraperitoneal injection of 0.9% NaCl at the same volume. Pregnant mice are slaughtered on gestational day 11.5 and the embryos are studied under a dissecting microscope.

Metabolism / Metabolites
Raltitrexed is transported into cells via a reduced folate carrier. Inside the cell it is extensively polyglutamated by the enzyme folyl polyglutamate synthetase to polyglutamate forms.

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Biological Half-Life
198 hours

Protein Binding
>93%

[1]. Raltitrexed Inhibits HepG2 Cell Proliferation via G0/G1 Cell Cycle Arrest. Oncol Res. 2016;23(5):237-48.

[2]. Raltitrexed's effect on the development of neural tube defects in mice is associated with DNA damage, apoptosis, and proliferation. Mol Cell Biochem. 2015 Jan;398(1-2):223-31.

[3]. Raltitrexed induces mitochondrial-mediated apoptosis in SGC7901 human gastric cancer cells. Mol Med Rep. 2014 Oct;10(4):1927-34.

[4]. Induction of intrachromosomal homologous recombination in human cells by raltitrexed, an inhibitor of thymidylate synthase. DNA Repair (Amst). 2008 Oct 1;7(10):1624-35.

ICI D1694 is a N-acyl-amino acid.
Raltitrexed (brand name Tomudex®) is a chemotherapy drug manufactured AstraZeneca Company, is an antimetabolite used in chemotherapy. It is an inhibitor of thymidylate synthase.
Raltitrexed is a quinazoline folate analogue with antineoplastic activity. After transport into cells via the reduced folate carrier, raltitrexed undergoes intracellular polyglutamation and blocks the folate-binding site of thymidylate synthase, thereby inhibiting tetrahydrofolate activity and DNA replication and repair and resulting in cytotoxicity. (NCI04)

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Drug Indication
For the treatment of malignant neoplasm of colon and rectum
Mesothelioma of the pleura

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Mechanism of Action
Raltitrexed is an antineoplastic Agents and folic acid antagonists. Raltitrexed inhibits thymidylate synthase (TS) leading to DNA fragmentation and cell death. It is transported into cells via a reduced folate carrier. Inside the cell Raltitrexed is extensively polyglutamated, which enhances thymidylate synthase inhibitory power and duration. Inhibition of this enzyme results in decreased synthesis of thymidine triphosphate which is required for DNA synthesis.

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Pharmacodynamics
Raltitrexed belongs to a group of medicines known as antimetabolites. It is used to treat cancer of the colon and rectum. It may also be used to treat other kinds of cancer, as determined by your doctor. Raltitrexed blocks an enzyme needed by the cell to live. This interferes with the growth of cancer cells, which are eventually destroyed. Since the growth of normal body cells may also be affected by raltitrexed, other effects will also occur. Some of these may be serious and must be reported to your doctor. Other effects, like hair loss, may not be serious but may cause concern.

C21H22N4O6S

458.49

458.126

C, 55.01; H, 4.84; N, 12.22; O, 20.94; S, 6.99

112887-68-0

135400182

Off-white to yellow solid powder

1.5±0.1 g/cm3

176-1800C

1.692

-1.28

180.93

4

9

9

32

790

1

CC(NC1=O)=NC2=C1C=C(CN(C)C3=CC=C(C(N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O)=O)S3)C=C2

IVTVGDXNLFLDRM-HNNXBMFYSA-N

InChI=1S/C21H22N4O6S/c1-11-22-14-4-3-12(9-13(14)19(28)23-11)10-25(2)17-7-6-16(32-17)20(29)24-15(21(30)31)5-8-18(26)27/h3-4,6-7,9,15H,5,8,10H2,1-2H3,(H,24,29)(H,26,27)(H,30,31)(H,22,23,28)/t15-/m0/s1

(2S)-2-[[5-[methyl-[(2-methyl-4-oxo-3H-quinazolin-6-yl)methyl]amino]thiophene-2-carbonyl]amino]pentanedioic acid

ZD-1694; ICID1694; ZD1694; D1694; ICI-D1694; D-1694; D 1694; ICID 1694; ZD 1694; TDX; trade name: Tomudex.

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.45 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.54 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.54 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: ≥ 2.1 mg/mL (4.5 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + + 45% Saline
≥ 2.1 mg/mL (4.5 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in saline)
≥2.1 mg/mL (4.5 mM) in 10% DMSO + 90% Corn oil

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。