Orexin receptor

OX2 受体在 [Ca2+]i 瞬时实验中的 EC50 为 60 nM，在结合测定中的 IC50 为 36 nM，表明它是人食欲素 B 的高亲和力受体。在竞争性结合测试中计算出的 IC50 和人食欲素-B 的 [Ca2+]i 瞬时实验中的 EC50 分别为 420 nM 和 2500 nM[2]。这表明人 Orexin B 对人 OX1 的亲和力要低得多。

大鼠的外视网膜含有杆状双极细胞 (RBC)，其活性受食欲素 B 调节。暗视视网膜电图 b 波是红细胞活动的镜像，在体内记录，其振幅在玻璃体内注射食欲素-B 后增加[4]。

解离红细胞中的全细胞膜片钳记录[4]
如前所述（Yu等人，2006），通过酶和机械处理，红细胞与视网膜急性分离，并进行了轻微的修改。简而言之，分离的视网膜在7-8小时内被消化 mg/ml含木瓜蛋白酶的Hanks溶液，加入l-半胱氨酸和牛血清白蛋白（每种0.75 mg/ml）约30 min 35-36岁 °C，用火焰抛光的巴斯德移液管轻轻研磨，机械分离。记录了浸泡在林格氏液中的解离红细胞的全细胞膜电流，其中含有以下物质（单位为mM）：NaCl 145、KCl 5、CaCl2 2、MgCl2 1、HEPES 10和葡萄糖16；用NaOH将pH值调节至7.4。这些电池的电压被箝位在-60 mV，用于电流记录的移液管填充有含有（以mM计）：CsCl 125、CaCl2 1、MgCl2 2、EGTA 10、HEPES 10、MgATP 2、NaGTP 0.4和磷酸肌酸钠10的内溶液；用CsOH将pH值调节至7.2，并调节至290-300mOsmol/L。GABA为50 μM施加5 s每2 min，通过贴片放大器从红细胞中拾取电流。 在切片和隔离电池的所有全电池记录实验中，快速电容被完全抵消，电池电容尽可能被放大器的电路部分抵消。记录电极的串联电阻的70%被补偿。所有记录均在室温（20-25°C）下拍摄。

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钙显像[4]
使用膜渗透指示剂fura-2 AM评估细胞内钙浓度（[Ca2+]i）的变化。将fura-2 AM溶解在20%Pluronic F-127（w/v，DMSO）中，并加入到含有林格氏菌的腔室中，最终fura-2 AM浓度为2 μM.将分离的红细胞在染料溶液中孵育45分钟 min 在室温下，然后用无染料林格氏液灌注至少30分钟 min。使用高速连续扫描单色光源在340 纳米和380 nm.每1-10次测量两个波长（F340和F380）的荧光强度 同时，用配备数字CCD相机的倒置显微镜获得数字荧光图像。两幅图像之间的比率与所研究细胞的[Ca2+]i成正比。

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食欲素-A（OXA）和食欲素-B（OXB）是来自同一130个氨基酸长的前体（前食欲素）的多肽，该前体结合并激活两个密切相关的孤儿G蛋白偶联受体OX1-R和OX2-R。这些下丘脑神经肽刺激食物摄入和能量消耗，在睡眠-觉醒调节中起着重要作用。本研究旨在探讨食欲素对培养的大鼠颅盖成骨样细胞（ROB）增殖活性和骨钙素分泌的影响。常规RT-PCR方法检测新鲜分离的ROB细胞和培养7、14和21天的细胞中OX1-R基因的表达。相比之下，在所有测试的时间点，都没有证明前OX或OX2-R基因的表达。QPCR显示，OX1-R基因在新鲜分离的骨细胞中表达最高，在培养的ROB细胞中表达明显较低。将培养的细胞暴露于OXA和OXB会刺激OX1-R基因的表达。然而，在最低测试浓度（1x10（-10）M）下可以看到这种效果。将培养的ROB细胞暴露于OXA 48小时，在培养的第7、14和21天分析的培养基中骨钙素浓度没有变化。相反，OXB显著刺激了培养第14天和第21天所取培养基中的骨钙素浓度。相比之下，OXA在培养的第7天对ROB细胞的增殖活性产生了显著的抑制作用，而OXB在第14天也产生了类似的作用。因此，所获得的结果表明：（i）（ROB）细胞具有功能性的OX1-R基因；（ii）在ROB细胞中，该基因的表达似乎被低浓度的OXA和OXB上调；（iii）OXB对培养的ROB细胞的增殖活性具有抑制作用，对骨钙素分泌具有刺激作用；（iv）具有OX受体的大鼠颅盖成骨细胞可能是循环食欲素的靶标。因此，食欲素可能被纳入参与主要骨细胞类型生理调节的神经肽的扩展组[3]。

Animal/Disease Models: Male Wistar rats (180 -200 g)[2].
Doses: 3 nM and 30 nM.
Route of Administration: Administered in a 5 mL bolus through a catheter placed in the left lateral ventricle in early light phase.
Experimental Results: Dramatically augmented food intake.

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Intravitreal injection [1]
Rats, dark-adapted for at least 4 h before the experiments, were deeply anesthetized with a mixture of 4% chloral hydrate (0.01 ml/g) and 0.05% atropine (0.02 ml/g) under dim red light illumination (approximately 1.4 lux at the cornea) provided by an LED. Orexin-Bof four doses (dissolved in 2 μL 0.9% saline) were intravitreally injected into the right eyes using a Nanoject II microinjector. The injection yielded final vitreal concentrations of Orexin-B corresponding to 0.1 μM, 0.3 μM, 1 μΜ and 3 μM respectively, given an average vitreal volume of 25 μL in rats. An equal volume of vehicle (0.9% saline) was injected into the contralateral eye as control.

[1]. Orexins: a new family of neuropeptides. Br J Anaesth. 1999 Nov;83(5):695-7.

[2]. Orexins and orexin receptors: a family of hypothalamic neuropeptides and G protein-coupled receptors that regulate feeding behavior. Cell. 1998 Feb 20;92(4):573-85.

[3]. Orexin B inhibits proliferation and stimulates specialized function of cultured rat calvarial osteoblast-like cells. Int J Mol Med. 2008;22(6):749-755.

[4]. Orexin-B modulates synaptic transmission of rod bipolar cells in rat retina. Neuropharmacology. 2018;133:38-50.

Orexin-A, -B play a crucial role in arousal and feeding by activating two G-protein-coupled receptors: orexin receptor 1 (OX1R) and orexin receptor 2 (OX2R). Orexins, along with orexin receptors, are expressed in retinal neurons, and they have been shown to differentially modulate excitatory AMPA receptors of amacrine and ganglion cells in the inner retina. In this work we report that orexin-B modulates the activity of rod bipolar cells (RBCs) located in the outer retina of rat. Intravitreal injection of orexin-B increased the amplitude of the scotopic electroretinographic b-wave, a reflection of RBC activity, recorded in vivo. Patch clamp recordings in rat retinal slices showed that orexin-B did not change glutamatergic excitatory component of the RBC response driven by photoreceptors. Effects of orexin-B on GABA receptor-mediated synaptic transmission of RBCs were then examined. In retinal slice preparations orexin-B suppressed GABA receptor-mediated inhibitory postsynaptic currents of RBCs in the inner plexiform layer. Furthermore, using whole-cell recordings in isolated RBCs it was shown that orexin-B suppressed GABAC receptor-, but not GABAA receptor-, mediated currents of the RBCs, an effect that was blocked by OX1R and OX2R antagonists. The orexin-B-induced inhibition of GABAC currents was likely mediated by a Gi/o/PC-PLC/Ca2+-independent PKC signaling pathway, as such inhibition was absent when each step of the above-pathway was blocked with GDP-β-S/pertussis toxin (for Gi/o), D609 (for PLC), bisindolylmaleimide IV (for PKC)/rottlerin (for PKCδ), respectively. The orexin-B-induced potentiation of RBC activity may improve visual acuity and contrast sensitivity of the animal during the dark period (wake phase).[4]

C₁₂₈H₂₁₆F₃N₄₅O₃₆S

3050.42

Orexin B, rat, mouse;202801-92-1

RPGPPGLQGRLQRLLQANGNHAAGILTM-NH2

Typically exists as solid at room temperature

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

H2O :~100 mg/mL (~32.78 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。