3-IN-PP1

PKD1 108 nM (IC50) Cellular PKD2 94 nM (IC50) PKD3 108 nM (IC50)

3-IN-PP1 对 PKD1、PKD2 和 PKD3 表现出强大的泛 PKD 抑制活性，IC50 值分别为 108、94 和 108 nM[1]。 3-IN-PP1（5 μM，0-114 小时）证明了对 PANC-1 细胞的强抗增殖作用[1]。 3-IN-PP1（20 μM，1 小时）可有效抑制 PANC-1 细胞的 PKD 依赖性皮质蛋白磷酸化[1]。 3-IN-PP1 抑制多种肿瘤细胞的发育，IC50 值范围为 1.6 至 39.2μM[1]。

PKD筛选试验[1]
采用Promega公司的体外发光法（ADP-Glo™）测定PKD磷酸化活性。Syntide-2作为底物，在不同浓度的化合物存在下进行初步筛选，浓度为1 μM，浓度为10 μM至1 nM进行IC50测定。反应在白色96孔平板（NUNC）上进行，反应体积为10 μL，反应体积为50 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM MgCl2, 8 nM PDBu刺激FLAG PKD， 250 μM Syntide-2和10 μM ATP。在30℃下孵育15min后，停止反应，用ADP-Glo试剂I和试剂II（比例1:1:2，即反应体积：试剂1：试剂2）按照厂家的方案孵育。随后，使用PerkinElmer Victor X4多板读取器以每秒计数（CPS）测量发光。测定PKD抑制率相对于DMSO对照（0.1% DMSO）的百分比。使用GraphPad Prism 7软件包绘制图表并测定IC50值。

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细胞筛选试验使用磷酸化接触蛋白作为PKD抑制的读数[1]
每个条件下以0.3 × 106个细胞的密度将PANC-1细胞接种在6孔板上，并允许贴壁。24小时后，用PEI转染0.5 μg pcDNA-FLAG-PRKD1或pcDNA-FLAG-PRKD2和0.5 μg pcDNA3-Myc-CTTN，质粒/PEI比例为1:3 （m/m）。24小时后，用最终浓度为20 μM或DMSO对照的指定化合物（图3）处理细胞1小时，然后用250 nM phorpol -12,13-二丁酸酯（PDBu）刺激或不刺激15分钟。裂解在50 mM Tris， pH 7.4, 150 mM NaCl, 15 mM EDTA， 1% NP-40补充磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂中进行。蛋白定量采用BCA蛋白测定法。接下来，等量的裂解物（10 μg）在SDS-PAGE中溶解，并将其印迹到硝化纤维素膜中。抗体非特异性结合用5%牛血清白蛋白或5%低脂牛奶阻断。印迹检测采用抗cortacn pSer-298抗体（自制）、抗myc 9E10抗体和抗flag M2抗体。最后，用合适的酶联抗体（山羊抗兔或马抗小鼠）孵育印迹。用Image Studio Lite对波段强度进行量化。Ponceau染色作为上样对照。通过使用Image Studio Lite软件中的锐化工具的默认设置，ponceau图像的清晰度得到了提高。实验一式三次（n = 3），采用均数和扫描电镜（SEM）作为统计手段。采用单因素方差分析确定对照条件（DMSO）的统计学显著性。采用GraphPad Prism 7软件包进行统计分析。

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CAMKIIα和PKCδ测定[1]
采用体外放射测定法测定不同浓度化合物对CAMKIIα和PKCδ的抑制作用。CAMKIIα测定用40 μL含有50 mM Tris-HCl pH 7.4、10 mM MgCl2、2 mM CaCl2、30 μg/μL Calmodulin、50 ng CAMKIIα、2 μg Syntide-2、25 μM ATP和2 μCi [γ-32P] ATP的混合物进行。PKCδ测定在40 μL的混合物中进行，该混合物中含有50 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM MgCl2, 4 μL磷脂酰丝氨酸(PS)/PDBu囊泡原液，50 ng PKCδ， 5 μg marks肽（内部合成），25 μM ATP和2 μCi [γ-32P] ATP。10 min后，在Whatman P81滤纸上滴加30 μL的反应液，停止激酶反应。滤纸用0.5%磷酸水溶液洗涤三次，再用100%丙酮洗涤一次。随后，纸张被风干并使用Tri-Carb 2810 TR闪烁计数器计数。相对于不添加抑制剂（0.1% DMSO）的情况，测定了抑制的百分比。使用GraphPad Prism 7软件包绘制图表。PS/PDBu囊泡的制备方法如下：将PDBu和PS混合至终浓度为100 μg/mL PS和250 nM PDBu，用Savant Speedvac浓缩器干燥。干燥的脂质在pH 7.4的50 mM Tris中重悬，超声三次，10分钟，直到得到清澈的溶液。

细胞增殖测定[1]
细胞类型： PANC-1 细胞
测试浓度： 5 μM
孵育时间： > 0-114 小时
实验结果： 孵育 96 小时和 144 小时后，显着抑制 PANC-1 细胞增殖。

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蛋白质印迹分析[1]
细胞类型： PANC-1 细胞
测试浓度： 20 μM
孵育时间： 1 小时
实验结果： PANC-1 细胞中的 cortactin 磷酸化减弱。

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增殖试验[1]
将PANC-1细胞以2000个/孔的速度接种在96孔板上，贴壁4小时。随后，将每种化合物添加至5 μM的浓度或将DMSO（vehicle）添加至0.25%的终浓度作为阴性对照。在加入终浓度为0.5 mg/mL的MTT（噻唑蓝溴化四唑铵）前，细胞分别生长0、48、96和144 h。细胞孵育3 h后用DMSO裂解。550nm处的吸光度作为细胞增殖的读数。进行4次增殖实验（n = 4），统计学方法为平均值和扫描电镜（SEM）。采用双因素方差分析结合Dunnett多重比较检验来确定与对照条件（DMSO）的统计学显著性。采用GraphPad Prism 7软件包进行统计分析。

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抗肿瘤试验[1]
所有细胞系均按供应商推荐的方法培养。培养基购自Gibco Life Technologies，添加10%胎牛血清。将贴壁细胞系LN-229、HCT-116、NCI-H460和Capan-1细胞以每孔400 - 1250个细胞的密度接种于384孔、黑壁、清底组织培养板中。孵育过夜后，用100 ~ 6.4 × 10−3 μM的七种不同浓度的化合物处理细胞。将悬浮细胞系HL-60、K-562、Z-138和DND-41以每孔2500 - 5000个细胞的密度接种于384孔、黑壁、清底组织培养板中，培养皿中含有相同7个浓度点的试验化合物。在诱导细胞中37℃孵育72 h，实时成像。每3小时拍摄一次图像，每口井在10倍放大镜下拍摄一张图像。所有化合物用重复数据点进行测试并取平均值。

[1]. Design, synthesis and biological evaluation of pyrazolo[3,4-d]pyrimidine-based protein kinase D inhibitors. Eur J Med Chem.

The multiple roles of protein kinase D (PKD) in various cancer hallmarks have been repeatedly reported. Therefore, the search for novel PKD inhibitors and their evaluation as antitumor agents has gained considerable attention. In this work, novel pyrazolo[3,4-d]pyrimidine based pan-PKD inhibitors with structural variety at position 1 were synthesized and evaluated for biological activity. Starting from 3-IN-PP1, a known PKD inhibitor with IC50 values in the range of 94-108 nM, compound 17m was identified with an improved biochemical inhibitory activity against PKD (IC50 = 17-35 nM). Subsequent cellular assays demonstrated that 3-IN-PP1 and 17m inhibited PKD-dependent cortactin phosphorylation. Furthermore, 3-IN-PP1 displayed potent anti-proliferative activity against PANC-1 cells. Finally, a screening against different cancer cell lines demonstrated that 3-IN-PP1 is a potent and versatile antitumoral agent.[1]

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Based on our previously identified PKD inhibitor 3-IN-PP1, a novel series of pyrazolo[3,4-d]pyrimidines was synthesized. Systematic structural variation at position 1 of this scaffold led to the discovery of 17m, which is the most potent pyrazolo[3,4-d]pyrimidine based pan-PKD inhibitor reported to date with IC50 values of 35, 35 and 17 nM for PKD1, 2 and 3, respectively. Despite the fact that compound 17m was 3- to 5-fold more potent in a biochemical PKD assay, when compared to 3-IN-PP1, compound 17m was less potent in cellular environments. On the other hand, 3-IN-PP1 very potently inhibited PKD activity in cells and blocked the proliferation of PANC-1 pancreatic cancer cells. Finally, a broad antitumoral screening revealed that 3-IN-PP1 is endowed with low-micromolar antiproliferative activity against 7 out of 8 cancer cell lines. Altogether, these data demonstrate that within the pyrazolo[3,4-d]pyrimidine based PKD inhibitors developed to date, 3-IN-PP1 clearly is the most potent antiproliferative agent.[1]

C17H18N6

306.365022182465

306.159

2227110-54-3

162663243

Off-white to light yellow solid powder

2.5

85.4

2

4

2

23

435

0

C1=NC(N)=C2C(C3C4=C(NC=3)C=CC=C4)=NN(C(C)(C)C)C2=N1

RBZLXANOQRQGTN-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C17H18N6/c1-17(2,3)23-16-13(15(18)20-9-21-16)14(22-23)11-8-19-12-7-5-4-6-10(11)12/h4-9,19H,1-3H3,(H2,18,20,21)

1-tert-butyl-3-(1H-indol-3-yl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine

3-IN-PP1; 2227110-54-3; CHEMBL4779081; BDBM50565687; PD195878;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮和光照。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 100 mg/mL (326.40 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.16 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.16 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.16 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。