Stafib-2

STAT5b（IC50 = 82 nM)

Stafib-2 对 STAT5b 的亲和力非常高 (Ki=8.8 nM)[1]。在 K562 和 MDA-MB-231 细胞中，stafib-2（3–10 μM；4-48 小时）不表现出任何可辨别的活性[1]。
利用等温滴定量热法（ITC）和蛋白质点突变体分析联合验证了Stafib-2的结合位点，这是首次利用ITC对野生型和突变型蛋白的功能比较，用氨基酸分辨率来表征STAT蛋白的小分子配体的结合位点。前药Pomstafib-2选择性抑制人白血病细胞中STAT5b酪氨酸磷酸化，并以stat5依赖的方式诱导细胞凋亡。我们提出Pomstafib-2作为一种化学工具来解决STAT5蛋白在不同细胞过程中所起作用的基本问题，Pomstafib-2是目前可用的最活跃的STAT5b活化选择性抑制剂

荧光偏振（FP）测定[1]
测试化合物取代荧光团标记肽（最终浓度：10 nM）从各自结合蛋白的能力如前所述进行了分析。肽序列为：STAT1: 5-羧基荧光素- gy (PO3H2)DKPHVL；STAT3: 5-carboxyfluorescein-GY (PO3H2) LPQTV-NH2;STAT4: 5-carboxyfluorescein-GY (PO3H2) LPQNID-OH;STAT5a和STAT5b: 5-羧基荧光素- gy (PO3H2)LVLDKW；STAT6: 5-carboxyfluorescein-GY (PO3H2) VPWQDLI-OH;Lck SH2: 5-羧基荧光素gy (PO3H2)EEIP。由于蛋白质不稳定，未对STAT2进行分析。最终蛋白浓度：STAT1: 420 nM；STAT3: 270 nM；STAT4: 130 nM；STAT5a: 130 nM；STAT5b: 100 nM；STAT6: 310 nM；lk SH2: 30 nM。这些浓度对应于各自蛋白-肽相互作用的kd值。移液部分使用Biomek FX机器人进行。在加入荧光标记的肽之前，将蛋白质和化合物孵育1小时。另外一个小时后，荧光偏振测量使用无限F500平板阅读器。最终缓冲液浓度：10 mM Tris (pH 8.0), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT， 0.1% Nonidet P-40替代品，2% DMSO。根据肽-蛋白结合曲线拟合，将FP的变化转化为抑制百分比。根据IC50数据，使用已发表的公式计算ki值。

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等温滴定热法（ITC） [1]
ITC实验在MicroCal VP-ITC量热计上进行。典型的滴定设置为：25°C细胞温度，150 s初始延迟，约20µM STAT蛋白在10 mM Tris中，50 mM NaCl, pH 8.0, 200µM化合物4作为四钠盐，搅拌速度300 rpm，参考功率为20µcal/s。所有的溶液在实验前都脱了气。结果数据通过NITPIC和SEDPHAT34进行分析，并拟合单位点结合模型，同时将4的浓度定义为固定。采用了低噪声热图积分方法。插图使用GUSSI制作。

Western Blots [1]
如前所述，转染培养的K562细胞并进行Western blotting。使用Fugene HD转染试剂(每孔1 × 106个细胞，1 ml培养基，DNA比例为4:1)。24 h后，分别用化合物或DMSO处理细胞4 h （DMSO终浓度0.2%）。收获后，细胞裂解（裂解缓冲液组成：50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM Na4P2O7, 10%甘油，1% Triton X-100, 1 mM EDTA， 100 ng/mL抑蛋白蛋白，1 mM Na3VO4, 10 mM NaF, 1 mM PMSF）。通过SDS-PAGE（10%）分离细胞裂解液组分，然后转移到硝化纤维素膜上。一抗(phospho-STAT5；STAT5;α-兔hrp二抗和ECL检测β-Actin)，并用ImageQuant成像仪进行可视化。采用ImageJ软件（NIH）进行信号定量。

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凋亡试验[1]
细胞凋亡检测如前所述16。简而言之，将K562细胞（每孔2.5 × 105个细胞）或MDA-MB-231细胞（每孔1 × 105个细胞）接种于24孔组织培养板中，用化合物8按指定浓度（终DMSO浓度：0.2%）处理48小时。48h后收获细胞。用温磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗MDA-MB-231细胞两次，然后用Accutase在37°C下孵育10分钟。用每孔的细胞培养上清进行精准酶中和和细胞重悬。收获后，细胞在4°C下3000 rpm离心5分钟，用冷PBS洗涤2次，再次离心。使用PE Annexin V凋亡检测试剂盒对细胞进行染色。将细胞重悬于结合缓冲液中，并与PE Annexin V和7-AAD在4℃下孵育30 min。用LSRⅱ型流式细胞仪检测细胞凋亡。

[1]. Rational development of Stafib-2: a selective, nanomolar inhibitor of the transcription factor STAT5b. Sci Rep. 2017 Apr 11;7(1):819.

The transcription factor STAT5b is a target for tumour therapy. We recently reported catechol bisphosphate and derivatives such as Stafib-1 as the first selective inhibitors of the STAT5b SH2 domain. Here, we demonstrate STAT5b binding of catechol bisphosphate by solid-state nuclear magnetic resonance, and report on rational optimization of Stafib-1 (Ki = 44 nM) to Stafib-2 (Ki = 9 nM). The binding site of Stafib-2 was validated using combined isothermal titration calorimetry (ITC) and protein point mutant analysis, representing the first time that functional comparison of wild-type versus mutant protein by ITC has been used to characterize the binding site of a small-molecule ligand of a STAT protein with amino acid resolution. The prodrug Pomstafib-2 selectively inhibits tyrosine phosphorylation of STAT5b in human leukaemia cells and induces apoptosis in a STAT5-dependent manner. We propose Pomstafib-2, which currently represents the most active, selective inhibitor of STAT5b activation available, as a chemical tool for addressing the fundamental question of which roles the different STAT5 proteins play in various cell processes.[1]

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We report the rational optimization of the STAT5b SH2 domain inhibitor Stafib-1 (2) to Stafib-2 (4), which displays significantly increased activity whilst maintaining high selectivity over the closely related SH2 domain of STAT5a. We provide the first application of solid-state NMR for the analysis of ligand binding to an SH2 domain. The high affinity of Stafib-2 for STAT5b allowed us to perform the first comparative analysis of binding between a small-molecule STAT SH2 domain ligand and wild-type versus mutant STAT proteins by ITC, providing experimental validation of the hydrophilic and hydrophobic Stafib-2 binding pockets of STAT5b. The pivaloyloxymethylester Pomstafib-2 (8) inhibits STAT5b phosphorylation in cultured human leukaemia cells with an IC50 of only 1.5 µM, without significantly affecting the phosphorylation of STAT5a, and increases the apoptotic rate of human leukaemia cells in a STAT5-dependent manner. Since Pomstafib-2 (8) currently represents the most active, selective inhibitor of STAT5b activation, we propose its use as a chemical tool to dissect the overlapping and non-redundant functions of the two STAT5 proteins in living cells.[1]

C28H26N2O12P2

644.4597697258

644.096

C, 52.18; H, 4.07; N, 4.35; O, 29.79; P, 9.61

2097938-74-2

129896883

White to off-white solid powder

1.8

210

6

12

13

44

1020

0

P(=O)(O)(O)OC1=C(C=CC(=C1)CNC(COC1C=CC(C(NC2C=CC(=CC=2)OC2C=CC=CC=2)=O)=CC=1)=O)OP(=O)(O)O

LJGIDZSIOSYQMR-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C28H26N2O12P2/c31-27(29-17-19-6-15-25(41-43(33,34)35)26(16-19)42-44(36,37)38)18-39-22-11-7-20(8-12-22)28(32)30-21-9-13-24(14-10-21)40-23-4-2-1-3-5-23/h1-16H,17-18H2,(H,29,31)(H,30,32)(H2,33,34,35)(H2,36,37,38)

[4-[[[2-[4-[(4-phenoxyphenyl)carbamoyl]phenoxy]acetyl]amino]methyl]-2-phosphonooxyphenyl] dihydrogen phosphate

Stafib-2; 2097938-74-2; Benzamide, 4-[2-[[[3,4-bis(phosphonooxy)phenyl]methyl]amino]-2-oxoethoxy]-N-(4-phenoxyphenyl)-; 4-((2-(4-((4-Phenoxyphenyl)carbamoyl)phenoxy)acetamido)methyl)-1,2-phenylene bis(dihydrogen phosphate); [4-[[[2-[4-[(4-phenoxyphenyl)carbamoyl]phenoxy]acetyl]amino]methyl]-2-phosphonooxyphenyl] dihydrogen phosphate; Stafib-2?; DTXSID601118678

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 50 mg/mL (77.58 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.88 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.88 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.88 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。