FAK (IC50 = 1.5 nM)

PND-1186对FAK的抑制作用不同于Src PTK抑制剂的作用。 PND-1186在体外抑制4T1乳腺癌的运动。 纳摩尔PND-1186水平在悬浮但非粘附条件下促进4T1凋亡。 PND-1186在球体生长条件下抑制FAK和p130Cas酪氨酸磷酸化。 PND-1186在纳摩尔浓度下减少软琼脂菌落数量和大小。 [1]

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使用针对 FAK Tyr-397 的抗磷酸特异性免疫印迹发现 PND-1186 在乳腺癌细胞中的 IC50 低于 100 nM [1]。 FAK 在小鼠 4T1 乳腺癌细胞中产生侵袭性和转移性细胞表型方面发挥着至关重要的作用。当 PND-1186 以不断增加的浓度（0.1 至 1.0 µM）引入 4T1 细胞时，FAK Tyr-397 磷酸化 (pY397) 会受到抑制，并且在一小时内，总 FAK 蛋白水平会升高[1]。

当在颈部皮下注射（30 mg/kg 或 100 mg/kg）时，PND-1186 通过诱导细胞凋亡来抑制 4T1 皮下肿瘤的生长[1]。

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PND-1186通过诱导细胞凋亡抑制4T1皮下肿瘤生长[1]
为了确定4T1肿瘤生长对PND-1186给药的敏感性，将mCherry荧光标记的4T1细胞在BALB/c小鼠皮下生长（图7）。在原发性肿瘤建立8天后，每12小时给药一次30mg/kg或100mg/kg的载体或PND-1186（每日两次，b.i.d.），持续5天，之后原位观察mCherry 4T1肿瘤，然后提取并称重（图7A和b）。尽管载体治疗的4T1肿瘤具有明亮的荧光，通常是多裂的，并且已经侵入周围组织，但用100mg/kg PND-1186治疗的小鼠肿瘤含有深色的非荧光中心，通常是圆形的，并且松散地附着在真皮下组织上（图7A）。100mg/kg PND-1186治疗显著降低了最终4T1肿瘤重量2倍（n=8，p<0.05），而30mg/kg PND-1186略微降低了最终肿瘤重量，但与对照组相比没有显著差异（n=8（p>0.05））。为了确定100mg/kg PND-1186肿瘤中心mCherry荧光的丧失是否与细胞凋亡增加有关，通过TUNEL（图7C和D）和抗切割胱天蛋白酶3（图7E）染色分析了中间切片。与赋形剂处理的对照组相比，30和100 mg/kg的PND-1186给药显著增加了肿瘤TUNEL染色（图7D）。由于在PND-1186治疗的小鼠的肿瘤中也发现了升高的切割半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3染色（图7E），这些结果与我们的体外分析相吻合，表明PND-1186在3D条件下促进4T1细胞的凋亡，从而抑制体内肿瘤生长。

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PND-1186在体内抑制卵巢癌肿瘤生长[1]
在卵巢癌肿瘤细胞进展过程中，细胞可以从原发性肿瘤中分离出来，并在腹膜空间内生长为多细胞球体32。由于PND-1186在3D环境中选择性地促进4T1乳腺癌细胞凋亡，因此在体外和体内评估了PND-1186对小鼠ID8卵巢癌细胞生长的影响（图8）。当在含有0.1µM PND-1186的悬浮细胞培养物中生长时，ID8细胞数量呈剂量依赖性减少，在72小时时显示出显著的抑制作用（图8A），并在15天后促进活细胞的急剧减少（图8B）。为了确定低水平的PND-1186是否会影响体内ID8的生长，将细胞腹腔注射到C57BL6小鼠体内，11天后，在5%蔗糖中为小鼠提供0.5mg/ml的PND-1166，以代替随意饮用水。在饮用水中添加PND-1186和蔗糖后，没有发现不良反应和体重减轻。治疗30天后，与蔗糖对照组相比，PND-1186显著减少了腹水相关细胞的数量（图8C），这与0.5mg/ml PND-1186给药几乎完全抑制FAK pY397有关（图8D和E）。综上所述，我们的结果表明，PND-1186在体外和体内抑制乳腺癌和卵巢癌细胞的生长。PND-1186在三维环境中促进细胞凋亡的选择性作用表明，FAK活性在产生锚定非依赖性存活信号方面发挥了新作用。

杆状病毒FAK催化结构域和体外激酶测定[1]
通过聚合酶链式反应，使用引物5'-cgatcgaattctcgaccagggatgatgagatca-3'5'-tagctgtcgacttactgaccttcctccctcgg-3'产生FAK催化结构域区域（411-686），将其克隆到pGEX4T中作为与GST的融合物，并转移到pAcG2T杆状病毒表达载体中。通过空斑试验鉴定病毒克隆并扩增。对于蛋白质表达，SF9细胞在2-5pfu/细胞的多重感染下转导，并在27°C下培养48小时。使用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析纯化GST-FAK（411-686），然后使用hiload 16/60 Superdex层析进行尺寸分级。将蛋白质浓缩并冷冻保存在50 mM Tris pH 8.0、150 mM NaCl、1 mM原钒酸钠、0.5 mM EDTA、0.5 mM EGTA、0.1%β-巯基乙醇和20%甘油中。SDS-PAGE估计纯度>90%。使用K-LISA筛选试剂盒和聚（Glu:Tyr）（4:1）共聚物作为固定在微量滴定板上的底物，测量GST-FAK体外激酶活性，并将其与His标记的FAK 411-686进行比较。在室温下，在含有50µM ATP和10 mM MnCl2、50 mM HEPES（pH 7.5）、25 mM NaCl、0.01%BSA和0.1 mM原钒酸钠的缓冲液中，用不同浓度的测试化合物测定IC50值5分钟。以½对数浓度（从1µM开始）对连续稀释的化合物进行了三次测试。使用辣根过氧化物酶偶联的抗pTyr抗体（PY20，Santa Cruz Biotechnology）通过分光光度法定量测定底物磷酸化。使用Hill Slope模型测定IC50值。激酶选择性分析是通过使用KinaseProfiler服务进行的。
PND-1186是通过高通量激酶活性筛选和常规药物化学方法鉴定的。如专利申请41中所述，PND-1186被合成并制备为HCl盐。

蛋白质印迹分析[1]
细胞类型： 4T1 乳腺癌细胞
测试浓度： 0.1、0.2、0.4、0.6 和 1.0 µM
孵育时间：1小时
实验结果：抑制FAK Tyr-397磷酸化（pY397）并导致FAK总蛋白水平升高。

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锚定依赖、球状和软琼脂细胞生长试验[1]
在贴壁（组织培养处理）和非贴壁条件下（聚HEMA涂层），将细胞（2×105）每35毫米孔铺在生长培养基中的6孔板上。在24至168小时之间，收集所有细胞，通过有限的胰蛋白酶-EDTA处理制备单细胞悬浮液，并通过台盼蓝染色和计数计数活细胞。为了确定球体面积，72小时后使用Olympus IX51显微镜对细胞进行相差成像。使用Image J软件（版本1.43）计算面积。对于软琼脂测定，48孔板涂有0.2 ml生长培养基中2%琼脂的1:4混合物（底层）。每孔5×104个细胞（一式三份）接种在0.2 ml生长培养基（顶层）中0.3%琼脂的混合物中。琼脂凝固后，加入0.2 ml含有DMSO或PND-1186的生长培养基（终浓度为0.6 ml）。在单独的实验中，4天后加入PND-1186。10天后，对菌落进行相位对比成像，通过计数9个场（每个孔3个场）进行计数，并使用Image J确定总面积。对于所有分析，实验点重复三次，实验重复至少两次。

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细胞生长和凋亡测定[1]
对于细胞生长分析，将贴壁或悬浮细胞用PND-1186处理指定时间，通过有限的胰蛋白酶处理收集为单细胞悬浮液，用70%乙醇固定，通过离心收集并用PBS洗涤。将细胞颗粒重新悬浮在300µl含碘化丙啶（PI）（10µg/ml）、无DNA酶RNA酶（100µg/ml，Qiagen）的PBS中，然后在37°C下搅拌1小时。通过流式细胞术分析样品，并使用ModFit LT3.2软件进行细胞周期分析。如28所述，通过PI染色检测作为细胞凋亡指标的亚二倍体DNA含量。对于细胞凋亡分析，用PND-1186处理贴壁或悬浮细胞，并如上所述进行收集，对藻红蛋白（PE）结合的膜联蛋白V结合和7-氨基肌动蛋白霉素（7-AAD）反应性进行染色，并在1小时内通过流式细胞术进行分析。象限门的位置基于细胞自发荧光（阴性）星孢菌素处理（阳性）对照。凋亡被计算为膜联蛋白V阳性细胞的百分比。在软琼脂试验中，通过目视检查至少200个细胞来定量凋亡，并将其定义为膜起泡或细胞收缩的出现。免疫印迹法还通过蛋白质裂解物中切割的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3抗体反应性的出现检测到细胞凋亡。

Animal/Disease Models: balb/c (Bagg ALBino) mouse[1]
Doses: 30 mg /kg or 100 mg/kg
Route of Administration: Injected (100 µL) subcutaneously (sc) in the neck region; every 12 h (twice-daily, bid) for 5 days.
Experimental Results: 100 mg/kg treatment Dramatically decreased final 4T1 tumor weight 2-fold whereas 30 mg/kg treatment slightly decreased final tumor weight but was not Dramatically different compared to control.

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Mouse tumor studies [1]
Six to eight week old female C57BL6 and BALB/c mice were used. All in vivo studies were carried out under an approved institutional experimental animal care and use protocol. Growing tumor cells were harvested by limited trypsinization, washed in PBS, and counted using a ViCell XR (Beckman) prior to injection. Cell viability as measured by trypan blue exclusion was >95%. For subcutaneous tumor growth, 1×106 mCherry-labeled 4T1 cells in 100 µl PBS were injected into the hindflank of Balb/C mice. After 8 days, mice with equal volume tumors (as measured using vernier calipers and determined by length × width2/2) were grouped (n=8 per group) and PND-1186 solubilized in polyethylene glycol 400 (PEG400) in PBS (1:1) was injected (100 µl) subcutaneously in the neck region at 30 mg/kg or 100 mg/kg every 12 hours. Control animals received PEG400:PBS injections and at 13 days, tumors were imaged in situ using an Olympus OV100 Intravital Fluorescence Molecular Imaging System, tumors were excised and weighed, half was frozen in OCT, and half was solubilized in protein lysis buffer for FAK phosphorylation analyses. For ID8 ovarian carcinoma tumor growth, 0.8 mL of 1×107 ID8 cells in PBS was intraperitoneal injected into C57BL6 mice. After 11 days, 0.5 mg/mL PND-1186 dissolved in 5% sucrose in water was provided for drinking and control mice received 5% sucrose (n=8 per group). Administration continued ad libitum for 30 days after which mice were euthanized, ascites fluid collected, cells obtained by centrifugation (2000 rpm for 5 min), cell volume measured by pipet, and then solubilized in protein lysis buffer for immunoblotting analyses.

PND-1186 has low intrinsic toxicity to mice

[1]. PND-1186 FAK inhibitor selectively promotes tumor cell apoptosis in three-dimensional environments. Cancer Biol Ther. 2010 May 15;9(10):764-77.

VS-4718 is under investigation in clinical trial NCT02215629 (Dose Escalation Study in Acute Myeloid or B-Cell Acute Lymphoblastic Leukemia).
FAK Inhibitor VS-4718 is an orally bioavailable focal adhesion kinase (FAK) inhibitor with potential antineoplastic activity. Upon administration, VS-4718 inhibits FAK, blocks fibronectin-stimulated FAK autophosphorylation of Tyr397, and may prevent the integrin-mediated activation of several downstream signal transduction pathways, including ERK, JNK/MAPK and PI3K/Akt. This results in the reduction of the number of cancer stem cells (CSCs) and inhibits tumor cell migration, proliferation and survival. The cytoplasmic tyrosine kinase FAK is a signal transducer for integrins and is constitutively activated in various tumor cell types; it is involved in tumor cell invasion, migration and proliferation and plays a key role in the development, function and survival of CSCs.

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Tumor cells can grow in an anchorage-independent manner. This is mediated in part through survival signals that bypass normal growth restraints controlled by integrin cell surface receptors. Focal adhesion kinase (FAK) is a cytoplasmic protein-tyrosine kinase that associates with integrins and modulates various cellular processes including growth, survival, and migration. As increased FAK expression and tyrosine phosphorylation are associated with tumor progression, inhibitors of FAK are being tested for anti-tumor effects. Here, we analyze PND-1186, a substituted pyridine reversible inhibitor of FAK activity with a 50% inhibitory concentration (IC50) of 1.5 nM in vitro. PND-1186 has an IC50 of ~100 nM in breast carcinoma cells as determined by anti-phospho-specific immunoblotting to FAK Tyr-397. PND-1186 did not alter c‑Src or p130Cas tyrosine phosphorylation in adherent cells, yet functioned to restrain cell movement. Notably, 1.0 µM PND-1186 (>5-fold above IC50) had limited effects on cell proliferation. However, under non-adherent conditions as spheroids and as colonies in soft agar, 0.1 µM PND-1186 blocked FAK and p130Cas tyrosine phosphorylation, promoted caspase-3 activation, and triggered cell apoptosis. PND-1186 inhibited 4T1 breast carcinoma subcutaneous tumor growth correlated with elevated tumor cell apoptosis and caspase 3 activation. Addition of PND-1186 to the drinking water of mice was well tolerated and inhibited ascites- and peritoneal membrane-associated ovarian carcinoma tumor growth associated with the inhibition of FAK Tyr-397 phosphorylation. Our results with low-level PND-1186 treatment support the conclusion that FAK activity selectively promotes tumor cell survival in three-dimensional environments.[1]

C25H26F3N5O3

501.5

501.198

C, 59.87; H, 5.23; F, 11.36; N, 13.96; O, 9.57

1061353-68-1

PND-1186 hydrochloride;1356154-94-3

25073775

White to gray solid powder

1.3±0.1 g/cm3

654.0±55.0 °C at 760 mmHg

349.3±31.5 °C

0.0±2.0 mmHg at 25°C

1.609

5.64

91.24

3

10

7

36

709

0

IGUBBWJDMLCRIK-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C25H26F3N5O3/c1-29-24(34)17-5-3-4-6-19(17)31-21-14-23(30-15-18(21)25(26,27)28)32-20-8-7-16(13-22(20)35-2)33-9-11-36-12-10-33/h3-8,13-15H,9-12H2,1-2H3,(H,29,34)(H2,30,31,32)

2-((2-((2-methoxy-4-morpholinophenyl)amino)-5-(trifluoromethyl)pyridin-4-yl)amino)-N-methylbenzamide.

SR-2156; VS-4718; PND-1186; PND 1186; 1061353-68-1; 2-((2-((2-Methoxy-4-morpholinophenyl)amino)-5-(trifluoromethyl)pyridin-4-yl)amino)-N-methylbenzamide;PND1186; SR 2516; SR2516; VS4718; VS 4718.

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.99 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.99 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.99 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 4 中的溶解度: 2% DMSO+30% PEG 300+5% Tween 80+ddH2O: 5mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。