GLP-1 receptor

肽型GLP-1受体激动剂治疗2型糖尿病（T2DM）的成功促使我们寻找能够激活GLP-1受体（GLP-1R）的口服生物可利用小分子，作为T2DM的有效靶点。本文报道了一种基于3，4，5，6-四氢-1H-1，5-新氨基偶氮并[4，5-b]吲哚支架的有效和选择性的GLP-1R正变构调节剂（PAM）的发现和表征。由HTS对该系列的优化得到GLP-1R配体结合模型的支持。生物体外测试显示最佳化合物19具有良好的ADME和药理学特性。体内药代动力学和药理学研究的表征表明，在强效内源性配体GLP-1（7-36）NH2的活性低得多的内源性降解产物GLP1（9-36）NH2中，19激活GLP-1R作为阳性变构调节剂（PAM）。虽然这些数据表明了小分子GLP-1R-PAM治疗T2DM的潜力，但仍需要对临床候选药物进行进一步优化[2]。

胰高血糖素样肽-1受体（GLP-1R）的激动导致血糖降低和体重减轻，是治疗2型糖尿病（T2D）和肥胖的一种治疗策略。我们开发了一种口服小分子GLP-1R激动剂达努格立隆（PF-06882961），并在人源化小鼠模型中发现其与注射肽GLP-1R兴奋剂具有相当的疗效。然后，我们完成了一项安慰剂对照、随机、双盲、多次递增剂量的1期研究（NCT03538743），在该研究中，我们招募了98名服用背景二甲双胍的T2D患者，并将他们随机分组，在8个队列中接受多次递增剂量达努格立隆或安慰剂28天。主要结果是不良事件评估、安全实验室测试、生命体征和12导联心电图。大多数不良事件是轻微的，最常见的是恶心、消化不良和呕吐。各组间的实验室值均无临床意义的AE。在第28天，达努格立隆治疗后心率普遍升高，但未报告心率不良事件。与安慰剂相比，在第28天，达努列普隆治疗的收缩压略有下降，舒张压变化相似。没有临床意义的心电图检查结果。在T2D的这项研究中，达努格立隆通常耐受性良好，其安全性与GLP-1R激动剂的作用机制一致[4]。

生物分析。Min6 Ca2+动员测定[3]
将MIN6-c4细胞以每孔5×104个细胞的密度接种到黑色96孔板中，并在37°C和5%CO2下培养20-24小时。对于细胞负载，吸取培养上清液，并根据制造商的说明将100μL的测定缓冲液（Krebs–Ringer缓冲液，10mM HEPES，0.1%BSA，2.5mM葡萄糖）和等体积的钙6染料（FLIPR钙6测定试剂盒，Molecular Devices，R8191）溶解在同一缓冲液中，添加到每个孔中。将细胞在37°C/5%CO2下孵育70分钟，并在黑暗中在室温下再平衡10分钟。为了评估受试化合物对葡萄糖介导的细胞内Ca2+增加的影响，在FLIPR Tetra仪器（分子装置）上检测期间，每个孔添加50μL的含有75 mM葡萄糖（最终浓度为15 mM葡萄糖）和受试化合物或DMSO的测定缓冲液。对于低血糖对照，添加50μL不含额外葡萄糖的饥饿缓冲液，以将最终葡萄糖浓度保持在2.5 mM。通过计算3 s至372 s的荧光读数曲线下的面积来量化钙通量。

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稳定表达人GLP-1R的PSC-HEK293细胞系中的cAMP刺激测定[3]
使用解冻和使用冷冻细胞在1536孔板中进行GLP-1R激动剂和阳性变构调节剂的体外细胞测定。使用前，将冷冻细胞在37°C下快速解冻，并用20mL细胞缓冲液（1×HBSS；20mM HEPES，0.1%BSA）洗涤（在900rpm下5分钟）。将细胞重悬于测定缓冲液（细胞缓冲液加2mM IBMX）中，并将其调节至100万个细胞/mL的细胞密度。向1536孔微量滴定板中加入2μL细胞（最终2000个细胞/孔）和2μL化合物，用于激动剂测定。对于PAM测定，应用了两种测定形式，即（a）用1μL不同剂量的化合物和1μL固定浓度（EC20）的GLP1（9–36）NH2进行增强子测定，以及（b）用1µL不同剂量GLP1（9-16）NH2和1μL 10μM和3μM化合物进行移位测定。将含有2μL每个细胞和化合物的混合物在室温下孵育30分钟
使用来自Cisbio Corp.的试剂盒（目录号62AM4PEC）基于HTRF（均匀时间分辨荧光）测定细胞的cAMP含量。在加入在裂解缓冲液（试剂盒组分）中稀释的HTRF试剂后，将板温育1小时，然后测量665/620nm的荧光比。使用内部软件计算剂量-反应结果Biost@t-Speed2.0版HTS，使用四参数逻辑模型

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人胰腺β细胞系1.1B4中的cAMP刺激测定[3]
使用人胰腺β细胞系1.1B4进行GLP-1（7-36）NH2、GLP1（9-36）NH2和测试化合物的体外细胞测定。在GLP-1R激活后，1.1B4细胞积聚细胞内的环磷酸腺苷（cAMP）。使用具有HTRF读数的商业免疫测定技术来测量环AMP的形成。在这些实验中，定量cAMP所需的所有试剂在试剂盒（目录号62AM4PEC，来自Cisbio Corp.，France）中提供，并根据供应商提供的方案应用。应用了两种测定形式，即（a）具有化合物浓度-反应曲线和固定浓度为10 nM的GLP1（9–36）NH2的增强子测定和（b）具有GLP1（9－36）NH2浓度-响应曲线和固定剂量为1μM的化合物的转移测定。20 000个细胞接种到96孔微量滴定板中。过夜培养后，将细胞洗涤两次，并将连续稀释的GLP-1R配体或试验化合物（含或不含各自固定浓度的试验化合物或GLP1（9–36）NH2）转移到细胞中。在与测试试剂孵育30分钟后，根据制造商的描述裂解细胞并制备用于cAMP测定。通过在665和620nm处的荧光测量、665/620nm比率的计算以及相对于阴性（0%）和阳性（100%）对照的效果百分比的表达来获得数据点。阴性对照为测定缓冲液（1×HBSS，0.1%BSA，1 mM IBMX），阳性对照为GLP-1（7-36）NH2。浓度-响应结果用内部软件计算Biost@t-Speed2.0版本LTS，使用四参数逻辑模型。使用SAS版本9.1.3中的Marquardt算法通过非线性回归获得调整。

稳定表达与绿色荧光蛋白 (GFP) 融合的 hGLP-1R（400,000 个细胞/孔）的 HEK293 细胞在 6 孔板上生长一整天，然后用 PF-06882961 刺激半分钟。在这些研究中，使用的激动剂浓度为 1 μM，已被证明可引起最大内化。为了测试内吞过程的可逆性，将细胞置于特定的孔中，用含有0.1% BSA的PBS冲洗3次，然后在37°C下再孵育2小时。用4％多聚甲醛在室温下固定细胞15分钟后，用含有0.1％BSA的PBS清洗细胞3次。

male cynomolgus monkeys
1 mg/kg, 5 mg/kg, 100 mg/kg
IV, Oral gavage

[1]. 20th SCI/RSC Medicinal Chemistry Symposium.

[2]. Design, Synthesis, and Pharmacological Evaluation of Potent\nPositive Allosteric Modulators of the Glucagon-like Peptide-1 Receptor\n(GLP-1R). J Med Chem. 2020 Mar 12;63(5):2292-2307..

[3]. POSSIBLE SIDE EFFECTS AND RISKS OF THE STUDY DRUG AND PROCEDURES.

[4].Nat Med. 2021 Jun;27(6):1079-1087.

The therapeutic success of peptidic GLP-1 receptor agonists for treatment of type 2 diabetes mellitus (T2DM) motivated our search for orally bioavailable small molecules that can activate the GLP-1 receptor (GLP-1R) as a well-validated target for T2DM. Here, the discovery and characterization of a potent and selective positive allosteric modulator (PAM) for GLP-1R based on a 3,4,5,6-tetrahydro-1H-1,5-epiminoazocino[4,5-b]indole scaffold is reported. Optimization of this series from HTS was supported by a GLP-1R ligand binding model. Biological in vitro testing revealed favorable ADME and pharmacological profiles for the best compound 19. Characterization by in vivo pharmacokinetic and pharmacological studies demonstrated that 19 activates GLP-1R as positive allosteric modulator (PAM) in the presence of the much less active endogenous degradation product GLP1(9-36)NH2 of the potent endogenous ligand GLP-1(7-36)NH2. While these data suggest the potential of small molecule GLP-1R PAMs for T2DM treatment, further optimization is still required towards a clinical candidate.[2]

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Agonism of the glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R) results in glycemic lowering and body weight loss and is a therapeutic strategy to treat type 2 diabetes (T2D) and obesity. We developed danuglipron (PF-06882961), an oral small-molecule GLP-1R agonist and found it had comparable efficacy to injectable peptidic GLP-1R agonists in a humanized mouse model. We then completed a placebo-controlled, randomized, double-blind, multiple ascending-dose phase 1 study ( NCT03538743 ), in which we enrolled 98 patients with T2D on background metformin and randomized them to receive multiple ascending doses of danuglipron or placebo for 28 d, across eight cohorts. The primary outcomes were assessment of adverse events (AEs), safety laboratory tests, vital signs and 12-lead electrocardiograms. Most AEs were mild, with nausea, dyspepsia and vomiting most commonly reported. There were no clinically meaningful AEs in laboratory values across groups. Heart rate generally increased with danuglipron treatment at day 28, but no heart-rate AEs were reported. Systolic blood pressure was slightly decreased and changes in diastolic blood pressure were similar with danuglipron treatment at day 28, compared with placebo. There were no clinically meaningful electrocardiogram findings. In this study in T2D, danuglipron was generally well tolerated, with a safety profile consistent with the mechanism of action of GLP-1R agonism.[4]

C35H41FN6O7

676.7345

555.23

C, 62.12; H, 6.11; F, 2.81; N, 12.42; O, 16.55

2230198-03-3

2230198-02-2 (free acid);2230198-03-3 (tris);

154702463

Solid powder

200

5

13

12

49

995

1

C1CO[C@@H]1CN2C3=C(C=CC(=C3)C(=O)O)N=C2CN4CCC(CC4)C5=NC(=CC=C5)OCC6=C(C=C(C=C6)C#N)F.C(C(CO)(CO)N)O

JEJPAGACGZQFHN-JIDHJSLPSA-N

InChI=1S/C31H30FN5O4.C4H11NO3/c32-25-14-20(16-33)4-5-23(25)19-41-30-3-1-2-26(35-30)21-8-11-36(12-9-21)18-29-34-27-7-6-22(31(38)39)15-28(27)37(29)17-24-10-13-40-245-4(1-6,2-7)3-8/h1-7,14-15,21,24H,8-13,17-19H2,(H,38,39)6-8H,1-3,5H2/t24-/m0./s1

(S)-2-((4-(6-((4-cyano-2-fluorobenzyl)oxy)pyridin-2-yl)piperidin-1-yl)methyl)-1-(oxetan-2-ylmethyl)-1H-benzo[d]imidazole-6-carboxylic acid 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol

PF-06882961 tris Danuglipron PF 06882961 PF06882961 PF-06882961 Tris salt

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: >10 mM

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。