NCT-503

PHGDH/3-phosphoglycerate dehydrogenase (IC50 = 2.5 µM)[1]

NCT-503 是一种 PHGDH 染料，可阻止细胞以丝氨酸方式合成 3-磷酸甘油酸 (IC50=2.5 μM)。 NCT-503 在一组 168 个 GPCR 中表现出可忽略不计的交叉反应性，并且对一组其他脱氢酶没有活性。 NCT-503 竞争测定中发现了 3-磷酸甘油酸 (3-PG) 和 NAD+ 共底物抑制的非竞争性机制。 NCT-503 针对 PHGDH 支持细胞系的 EC50 为 8–16 μM，针对 MDA-MB-231 细胞的 EC50 高出 6–10 倍，并且对其他 PHGDH 非支持细胞系没有毒性 [1]。

NCT-503具有良好的代谢、排泄、折叠和吸收（ADME）特性。腹腔香料给药后，NCT-503表现出相当大的分布、良好的吸收、半衰期为2.5小时、在腹部的Cmax为20 μM。 NCT-503 治疗可降低 PHGDH 依赖性 MDA-MB-468 异种移植物的生长和重量，而不依赖 PHGDH 的 MDA-MB-231 异种移植物的生长和重量不受影响 [1]。

酶活性测定[1]
PHGDH测定缓冲液含有50mM TEA pH 8.0、10mM MgCl2、0.05%BSA和0.01%Tween-20。PHGDH酶缓冲液由含有20nM PHGDH和0.2mg/mL黄递酶的测定缓冲液组成。PHGDH底物缓冲液含有0.3 mM NAD+、1.25 mM谷氨酸、0.1 mM 3-磷酸甘油酸、0.2 mM雷沙祖林、1µM PSAT1和1µM PSP。在1536孔板中进行qHTS，所述孔板分配有BioRAPTR FRD。每个孔包含相等体积的底物缓冲液和测定缓冲液。在室温下用ViewLux uHTS微孔板成像仪在0分钟和20分钟读取板。在20µL酶缓冲液中的黑色384孔板中进行后续测定，用HP D300数字分配器以剂量反应向其中添加化合物，然后添加20µL底物缓冲液。将平板在室温（25°C）下孵育，并在0和20分钟时用Spectramax M5平板读取器在荧光强度模式下读取，λex=550 nm，λem=600 nm（发射截止值=590 nm）。使用DynaFit 33鉴定抑制模型。将酶浓度固定在10nM，并允许Km、Ki和Vmax变化。数据适用于复杂平衡的竞争性、无竞争性、非竞争性和混合抑制模型。Km值没有受到太大影响，通过F检验，适用于非竞争性模型的概率高于所有其他模型（3-PG为91.5%，NAD+为84.6%）。
GAPDH底物缓冲液含有210 mM Tris pH 7.4、2.5 mM NaH2PO4 pH 7.4、2 mM DL甘油醛3-磷酸、1.75 mM MgCl2、0.01 mM NAD+、0.11 mM雷沙祖林、0.2 mg/mL BSA和0.01%吐温-20。GAPDH酶缓冲液含有50mM Tris pH 7.4、100mM NaCl、0.02mM TCEP、0.01mM EDTA、0.1mg/mL BSA、0.42mg/mL黄递酶和2.5nM GAPDH。GAPDH、GPD1和GPD1L测定在384孔板中使用与PHGDH测定相同的方案和读数进行。GPD1底物缓冲液含有114mM Tris pH 7.4、0.25mM DHAP、1.14mM MgCl2、0.011mM NADH、0.06mg/mL BSA和0.011%吐温-20。GPD1酶缓冲液含有50 mM Tris pH 7.4、100 mM NaCl、0.08 mM TCEP、0.4 mg/mL BSA、0.03µM EDTA和0.8 nM GPD1。将70µL底物缓冲液与10µL酶缓冲液混合。
GPD1L底物缓冲液含有200mM Tris pH 7.4、0.05mM sn-G3-P、2mM MgCl2、0.04mM NAD+、0.11mM雷沙祖林、0.1mg/mL BSA和0.02%吐温-20。GPD1L酶缓冲液含有50 mM Tris pH 7.4、100 mM NaCl、0.02 mM TCEP、0.42 mg/mL黄递酶、0.1 mg/mL BSA、0.008µM EDTA和16 nM GPD1L。将40µL底物缓冲液与40µL酶缓冲液混合。
使用与PHGDH测定相同的方案读取GAPDH和GPD1L测定。使用NADH荧光损失读取GPD1测定（λex=340nm和λem=460nm）
通过计算ΔRFU（在T=0和T=30分钟之间间苯二酚荧光的增加）并将0×和1×PHGDH酶对照的ΔRFU值分别标准化为100%和0%PHGDH抑制来分析PHGDH的抑制数据。每个1536孔测定板的32孔专用于这些0×和1×PHGDH对照中的每一个。这些标准化的剂量反应值在GraphPad Prism中绘制，并使用Sigmoidal剂量反应（可变斜率）方程拟合。然后对每个重复的IC50进行平均，以确定具有标准偏差的平均IC50。

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热位移测定[1]
在体积为10µL的20mM TEA pH 8、100mM NaCl、1×SYPRO Orange和2µM PHGDH中进行差示扫描荧光测定。使用LightCycler 480 II实时PCR仪器（λex=465nm和λem=580nm）在20至85°C的线性梯度上监测展开。用HP D300数字分配器分配化合物，并将所有样品中的DMSO浓度标准化为1%。在LightCycler软件中生成荧光的一阶导数与温度的关系图。

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高通量PAMPAProtocol[1]
采用搅拌双槽PAMPA法通过PAMPA被动扩散测定化合物的渗透性。人工膜含有专有的脂质混合物和十二烷，经过优化可预测胃肠道（GIT）被动扩散渗透性。将膜固定在置于96孔“受体”板上方的96孔“供体”滤板的塑料基质上。在“供体”和“受体”孔中均使用pH 7.0的溶液。在含水缓冲液（pH 7.4）中将DMSO中的10mM化合物储备稀释至0.05mM，DMSO的最终浓度为0.5。在室温下30分钟的渗透期内，搅拌“供体”室中的测试样品。使用紫外板读数器（Nano Quant，Infinite®200 PRO，Tecan股份有限公司，Männedorf，Switzerland）测量“供体”和“受体”室中的化合物浓度。使用Pion股份有限公司软件进行渗透率计算，单位为10−6cm/s。所有样品均一式两份进行测试，每次试验均包括对照化合物（雷尼替丁、地塞米松和维拉帕米）。

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高通量动力学溶解度测试方案[1]
使用µSOL测定法对化合物进行动力学溶解度测定，该测定法将经典的饱和摇瓶溶解度法适用于96孔微量滴定板形式，并使用正丙醇的共溶剂法。在10mM DMSO溶液中制备测试化合物，并在掺入水溶液（pH 7.4）之前用共溶剂稀释。水溶液中的最终药物浓度为150µM。将样品在室温下孵育6小时，并过滤以除去沉淀物。通过直接紫外测量（λ：250–498 nm）测定滤液中的药物浓度。共溶剂中17µM的参考药物浓度用于滤液中未知药物浓度的定量。用作共溶剂的光谱纯正丙醇抑制了参比溶液中的沉淀。使用µSOL Evolution软件计算动力学溶解度（µg/mL）。所有样品一式两份进行测试，每次测试均包括对照化合物（阿苯达唑、苯唑吡啶和呋塞米）。

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高通量大鼠肝微粒体稳定性测定方案[1]
在单个时间点在96孔板中测定供试品的微粒体稳定性。通过LC/MS/MS测定化合物浓度，并用于计算体外半衰期。所有样品一式两份进行测试，每次测试六种标准对照：丁螺环酮和普萘洛尔（短半衰期）、洛哌丁胺和双氯芬酸（短至中半衰期）、卡马西平和安替比林（长半衰期）。测定孵育系统由0.5 mg/mL微粒体蛋白、1.0µM药物浓度和NADPH再生系统（含有0.650 mM NADP+、1.65 mM葡萄糖6-磷酸、1.65 M M MgCl2和0.2单位/mL G6PDH）组成，在pH 7.4的100 mM磷酸盐缓冲液中。在37°C下孵育15分钟，并通过加入555µL乙腈（约1:2比例）（含0.28µM阿苯达唑（内标））淬灭。在3000 rpm下离心20分钟后，将30µL上清液转移到分析板上，并使用1:2 v/v乙腈/水稀释5倍，然后用LC/MS−MS分析样品。

细胞毒性实验[1]
将细胞以2000个细胞/孔（MDA-MB-468、BT-20、MT-3）或1000个细胞/孔（所有其他细胞系）的密度接种在白色96孔板中，并使其附着24小时。在DMSO中制备化合物，并使用HP D300化合物分配器进行分配。在处理后4天用Cell Titer Glo评估细胞活力，并用SpectraMax M5平板读取器测量发光。在相同的培养基中将发光标准化为未处理的对照。对于挽救实验，RPMI补充40µM腺苷、尿苷、鸟苷、胞苷、脱氧腺苷、胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷，并每天更换培养基。

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耗氧量测量[1]
使用XF24细胞外通量分析仪测量完整MDA-MB-468细胞的耗氧量。将85000个细胞接种在RPMI培养基中，并暴露于10和50µM的化合物中。每个测量值代表六个独立井的平均值。

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代谢物分析：稳态和标记实验[1]
将细胞以每孔400000个细胞的6孔板均匀接种，并使其附着24小时。在所有标记实验之前，用10µM化合物或等效体积的DMSO在RPMI中预处理细胞1小时。对于稳态代谢产物浓度，在缺乏丝氨酸和甘氨酸的RPMI中预处理和处理之前，用PBS洗涤细胞。对于标记实验，U-13C-葡萄糖、U-13C-丝氨酸或U-13C-甘氨酸取代了相应的未标记的RPMI组分。将细胞在4°C 0.9%（w/v）NaCl的LCMS级水中洗涤，并在1 mL/孔的80:20（v/v）甲醇：水中提取，以0.01 ng/mL Val-d8和Phe-d8作为内提取标准。提取溶剂在氮气下干燥，代谢物样品在−80°C下储存，直到进行分析。对三硅酸盐相同接种和处理的孔进行胰蛋白酶消化，并用Multisizer Coulter计数器进行分析，以获得用于标准化的细胞计数和总细胞体积。

Mouse orthotopic xenografts[1]
Female NOD.CB17-Prkdcscid/J mice, 6–8 weeks old, were obtained from Jackson Laboratories. All animals were provided with food ad libitum for the duration for the duration of the experiment. The animals were allocated randomly for induction with MDA-MB-231 or MDA-MB-468 tumors and tumor group was assigned blindly. 500,000 MDA-MB-231 or MDA-MB-468 cells were injected into the 4th mammary fat pad of each mouse. After 30 days, the tumors were palpable, and the mice were pooled by tumor type and divided randomly to two groups, which were assigned blindly to vehicle or NCT-503 treatment. Each arm contained 10 mice for a total of forty mice in all arms. NCT-503 was prepared in a vehicle of 5% ethanol, 35% PEG 300, and 60% of an aqueous 30% hydroxypropyl-β-cyclodextrin solution, and injected intraperitoneally once daily. Dose was adjusted to mouse weight, and the volume of injection did not exceed 150 µL. Caliper measurements were obtained twice weekly and tumor volumes were calculated with the modified ellipsoid formula: volume = 0.5 × width2 × length.
For quantitation of necrotic regions, fixed tumors were embedded and sections stained with hematoxylin and eosin. Slides were scanned with a Leica Aperio AT2 brightfield scanner. Tumor and necrotic cross-sectional regions were manually delineated and measured using Leica ImageScope software to calculate the percentage of necrosis.

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Glucose infusions in mice[1]
Chronic catheters were surgically implanted into the jugular veins of normal or tumor bearing animals 3–4 days prior to infusions. Animals were fasted for 6 hours (morning fast) and infusions were performed in free-moving, conscious animals at 1:00pm for all studies to minimize metabolic changes associated with circadian rhythm. Following administration of either vehicle or NCT-503 at 30 mg/kg, a constant infusion of U-13C-glucose (30 mg/kg/min) was administered for a 3-hour duration. Animals were terminally anesthetized with sodium pentobarbital and all tissues were fully harvested in less than 5 minutes to preserve the metabolic state. Tumors and adjacent lung tissue were carefully dissected and rapidly frozen using a BioSqueezer to ensure rapid quenching of metabolism throughout the tissue section. Tissues were stored at −80C and extracted with 80:20 (v/v) methanol:water in the same manner as cells prior to LCMS analysis.

[1]. A PHGDH inhibitor reveals coordination of serine synthesis and one-carbon unit fate. Nat Chem Biol. 2016 Jun;12(6):452-8.

Serine is both a proteinogenic amino acid and the source of one-carbon units essential for de novo purine and deoxythymidine synthesis. In the canonical pathway of glucose-derived serine synthesis, Homo sapiens phosphoglycerate dehydrogenase (PHGDH) catalyzes the first, rate-limiting step. Genetic loss of PHGDH is toxic toward PHGDH-overexpressing breast cancer cell lines even in the presence of exogenous serine. Here, we used a quantitative high-throughput screen to identify small-molecule PHGDH inhibitors. These compounds reduce the production of glucose-derived serine in cells and suppress the growth of PHGDH-dependent cancer cells in culture and in orthotopic xenograft tumors. Surprisingly, PHGDH inhibition reduced the incorporation into nucleotides of one-carbon units from glucose-derived and exogenous serine. We conclude that glycolytic serine synthesis coordinates the use of one-carbon units from endogenous and exogenous serine in nucleotide synthesis, and we suggest that one-carbon unit wasting thus may contribute to the efficacy of PHGDH inhibitors in vitro and in vivo.[1]

C20H23F3N4S

408.4872

408.159

C, 58.81; H, 5.68; F, 13.95; N, 13.72; S, 7.85

1916571-90-8

1916571-90-8

118796328

Typically exists as off-white to light yellow solids at room temperature

1.3±0.1 g/cm3

474.3±55.0 °C at 760 mmHg

240.6±31.5 °C

0.0±1.2 mmHg at 25°C

1.611

2.61

63.5Ų

1

6

3

28

514

0

S=C(N([H])C1=C([H])C(C([H])([H])[H])=C([H])C(C([H])([H])[H])=N1)N1C([H])([H])C([H])([H])N(C([H])([H])C2C([H])=C([H])C(C(F)(F)F)=C([H])C=2[H])C([H])([H])C1([H])[H]

PJNSZIQUFLWRLH-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C20H23F3N4S/c1-14-11-15(2)24-18(12-14)25-19(28)27-9-7-26(8-10-27)13-16-3-5-17(6-4-16)20(21,22)23/h3-6,11-12H,7-10,13H2,1-2H3,(H,24,25,28)

N-(4,6-dimethylpyridin-2-yl)-4-(4-(trifluoromethyl)benzyl)piperazine-1-carbothioamide

NCT-503; NCT 503; NCT-503; 1916571-90-8; N-(4,6-dimethylpyridin-2-yl)-4-(4-(trifluoromethyl)benzyl)piperazine-1-carbothioamide; N-(4,6-dimethylpyridin-2-yl)-4-[[4-(trifluoromethyl)phenyl]methyl]piperazine-1-carbothioamide; NCGC00351958-05; N-(4,6-dimethylpyridin-2-yl)-4-{[4-(trifluoromethyl)phenyl]methyl}piperazine-1-carbothioamide; CHEMBL4099051; SCHEMBL17927258; NCT503.

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~50 mg/mL (~122.41 mM)
Ethanol : ~13.33 mg/mL (~32.63 mM)

配方 1 中的溶解度: 2.5 mg/mL (6.12 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.12 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 3 中的溶解度: 10 mg/mL (24.48 mM) in 50% PEG300 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 4 中的溶解度: 2 mg/mL (4.90 mM) in 0.5% methylcellulose 0.2% Tween 80 (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。