SE/squalene epoxidase

在 MIN6 细胞中，NB598 (10 μM) 使总胆固醇水平降低 36±7%。在 PM、ER 和 SG 中，NB598 分别显着降低了 49±2%、46±7% 和 48±2% 的胆固醇。在基础（1 mM 葡萄糖）和葡萄糖刺激（16.7 mM 葡萄糖）条件下，NB598 剂量依赖性地减少胰岛素分泌。在剂量高达 10 μM 时，NB598 可增强电流失活，但对峰值外向 KV 电流或激活的电压依赖性没有影响 [1]。 NB-598 (10 μM) 抑制[14C]乙酸酯合成甾醇和甾醇酯，但其他脂质包括磷脂 (PL)、游离脂肪酸 (FFA) 和三酰甘油 (TG) 不受影响。当不存在外源脂质体胆固醇时，NB-598 使 ACAT 活性降低 31%。即使脂质体胆固醇浓度为 600 PM，NB-598 也会导致 ACAT 活性降低 22%[2]。 NB-598 抑制 HepG2 细胞向培养基中释放三酰甘油和胆固醇 [3]。

发现NB-598，（E）N-乙基-N-（6,6-二甲基-2-庚烯-4-炔基）-3-[（3,3'-联噻吩-5-基）甲氧基]苯甲胺以竞争方式抑制人微粒体角鲨烯环氧化酶（来自Hep G2细胞）。NB-598剂量依赖性地抑制Hep G2细胞中[14C]乙酸酯的胆固醇合成，并增加角鲨烯的细胞内放射性。单次口服NB-598可抑制大鼠[14C]醋酸盐合成胆固醇。此外，对狗多次口服NB-598可降低血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平，并提高血清角鲨烯水平。治疗终止后，血清胆固醇降低和角鲨烯水平升高恢复到对照值[4]。

NB-598是角鲨烯环氧化酶的特异性抑制剂，抑制了HepG2细胞向培养基中分泌胆固醇和三酰甘油。L-654969是3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶的抑制剂，与NB-598一样有效地抑制胆固醇的分泌，但不抑制三酰甘油的分泌。这两种化合物几乎同样降低了细胞内胆固醇含量，两种化合物都没有降低细胞内三酰甘油含量。NB-598抑制脂质分泌与载脂蛋白（apo）B分泌到培养基中的显著减少有关。因此，NB-598对脂质分泌的抑制可能是由于富含三酰甘油的脂蛋白颗粒数量的减少造成的。相比之下，L-654969对胆固醇分泌的抑制可能是由于脂蛋白脂质组成的调节，因为这种药物没有减少载脂蛋白B或三酰甘油的分泌。载脂蛋白A-I的分泌不受NB-598或L-654969的影响。使用[35S]蛋氨酸的脉冲追踪研究表明，NB-598对载脂蛋白B分泌的抑制取决于对载脂素B细胞内降解的增强。这些结果表明，HepG2细胞中载脂蛋白B的分泌不是由单独的脂质合成调节的，并表明NB-598的降血脂作用机制涉及抑制肝脏中富含三酰甘油的脂蛋白分泌以及抑制肝脏中的胆固醇合成[3]。

质膜、内质网和胰岛素分泌颗粒的亚细胞分级[1]
在添加10%脱脂FBS的培养基中，在37℃下培养MIN6细胞（4×108）48小时，不存在或存在10μMNB598。收获细胞并在分级缓冲液中均质化：50 mM 2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）、250 mM蔗糖（pH 7.2）用于质膜（PM）和内质网（ER）；用于胰岛素分泌颗粒（SG）的10 mM 3[N-吗啉代]丙磺酸Tris、270 mM蔗糖（pH 6.8）。PM和ER的分级是通过Ramanadham等人建立的蔗糖密度梯度超速离心进行的。胰岛素分泌颗粒用Histodenz梯度超速离心分级，然后用Brunner等人建立的Percoll纯化。分离的亚细胞组分储存在-20℃下，用于蛋白质浓度测定和胆固醇提取

---

胆固醇含量测定[1]
在不存在或存在10μM胆固醇生物合成抑制剂NB598的情况下，将小鼠或人类的MIN6细胞（5×105）或20个胰岛在37℃下在添加了10%脱脂FBS的相对培养基中培养48小时。收集细胞和胰岛，用PBS洗涤。通过加入50μl 2:1氯仿-甲醇混合物提取胆固醇，然后加入100μl PBS。为了从亚细胞组分中提取胆固醇，将50μl 2:1氯仿-甲醇混合液加入不同的隔室。在10000rpm下离心3分钟后，去除顶部水相。将胆固醇样品干燥并溶解在10-40μl的免疫沉淀缓冲液中，该缓冲液含有（以毫摩尔计）150 NaCl、20 Tris-HCl、5 MgSO4、1 EDTA、1 EGTA和1%Triton X-100。按照制造商的说明，使用荧光分析试剂盒测量胆固醇含量。

---

使用在膜过滤器上生长的Caco-2细胞作为模型，研究角鲨烯环氧化酶抑制剂NB-598对肠上皮细胞吸收胆固醇的影响。NB-598（10微M）抑制[14C]乙酸酯合成甾醇和甾醇酯，而不影响其他脂质如磷脂（PL）、游离脂肪酸（FFA）和三酰基甘油（TG）的合成。当标记的脂质以胶束脂质溶液的形式顶部加载到Caco-2细胞培养物中时，NB-598降低了胆固醇、胆固醇酯、PL和TG中基侧分泌的放射性。此外，NB-598-抑制了载脂蛋白（apo）B的基侧分泌。当由对照Caco-2细胞制备的微粒体与10μM NB-598一起孵育时，酰基辅酶a：胆固醇酰基转移酶（ACAT）活性受到轻微抑制。在用10微米NB-598孵育Caco-2细胞后，还观察到细胞ACAT活性略有降低。这些结果表明，抑制肠上皮中含载脂蛋白B颗粒的分泌和降低细胞ACAT活性是NB-598降低胆固醇作用机制的一部分[2]。

[1]. Xia F, et al. Inhibition of cholesterol biosynthesis impairs insulin secretion and voltage-gated calcium channel function in pancreatic beta-cells. Endocrinology. 2008 Oct;149(10):5136-45.
[2]. Horie M, et al. Effects of NB-598, a potent squalene epoxidase inhibitor, on the apical membrane uptake of cholesterol and basolateral membrane secretion of lipids in Caco-2 cells. Biochem Pharmacol. 1993 Jul 20;46(2):297-305.
[3]. Horie M, et al. An inhibitor of squalene epoxidase, NB-598, suppresses the secretion of cholesterol and triacylglycerol and simultaneously reduces apolipoprotein B in HepG2 cells. Biochim Biophys Acta. 1993 May 20;1168(1):45-51.
[4]. NB-598: a potent competitive inhibitor of squalene epoxidase. J Biol Chem . 1990 Oct 25;265(30):18075-8.

Insulin secretion from pancreatic beta-cells is mediated by the opening of voltage-gated Ca2+ channels (CaV) and exocytosis of insulin dense core vesicles facilitated by the secretory soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor protein machinery. We previously observed that beta-cell exocytosis is sensitive to the acute removal of membrane cholesterol. However, less is known about the chronic changes in endogenous cholesterol and its biosynthesis in regulating beta-cell stimulus-secretion coupling. We examined the effects of inhibiting endogenous beta-cell cholesterol biosynthesis by using the squalene epoxidase inhibitor, NB598. The expression of squalene epoxidase in primary and clonal beta-cells was confirmed by RT-PCR. Cholesterol reduction of 36-52% was observed in MIN6 cells, mouse and human pancreatic islets after a 48-h incubation with 10 mum NB598. A similar reduction in cholesterol was observed in the subcellular compartments of MIN6 cells. We found NB598 significantly inhibited both basal and glucose-stimulated insulin secretion from mouse pancreatic islets. CaV channels were markedly inhibited by NB598. Rapid photolytic release of intracellular caged Ca2+ and simultaneous measurements of the changes in membrane capacitance revealed that NB598 also inhibited exocytosis independently from CaV channels. These effects were reversed by cholesterol repletion. Our results indicate that endogenous cholesterol in pancreatic beta-cells plays a critical role in regulating insulin secretion. Moreover, chronic inhibition of cholesterol biosynthesis regulates the functional activity of CaV channels and insulin secretory granule mobilization and membrane fusion. Dysregulation of cellular cholesterol may cause impairment of beta-cell function, a possible pathogenesis leading to the development of type 2 diabetes. Endocrinology . 2008 Oct;149(10):5136-45.

C27H32CLNOS2

486.13

449.185

C, 72.12; H, 6.95; N, 3.11; O, 3.56; S, 14.26

131060-14-5

NB-598 Maleate;155294-62-5;NB-598 hydrochloride;136719-25-0

6443223

Off-white to light yellow solid powder

1.122g/cm3

530.7ºC at 760mmHg

-60ºC

274.8ºC

2.4E-11mmHg at 25°C

1.596

7.483

68.95

0

4

10

31

628

0

CCN(C/C=C/C#CC(C)(C)C)CC1=CC=CC(OCC2=CC(C3=CSC=C3)=CS2)=C1

WDXQLZXORYGXJN-WVLIHFOGSA-N

InChI=1S/C27H31NOS2.ClH/c1-5-28(14-8-6-7-13-27(2,3)4)18-22-10-9-11-25(16-22)29-19-26-17-24(21-31-26)23-12-15-30-20-23/h6,8-12,15-17,20-21H,5,14,18-19H2,1-4H31H/b8-6+ SMILES

(E)-N-ethyl-6,6-dimethyl-N-[[3-[(4-thiophen-3-ylthiophen-2-yl)methoxy]phenyl]methyl]hept-2-en-4-yn-1-aminehydrochloride

NB-598; NB 598; CHEMBL27885; Benzenemethanamine, 3-([3,3'-bithiophen]-5-ylmethoxy)-N-[(2E)-6,6-dimethyl-2-hepten-4-yn-1-yl]-N-ethyl-; (E)-N-(3-([3,3'-Bithiophen]-5-ylmethoxy)benzyl)-N-ethyl-6,6-dimethylhept-2-en-4-yn-1-amine; (E)-N-ethyl-6,6-dimethyl-N-[[3-[(4-thiophen-3-ylthiophen-2-yl)methoxy]phenyl]methyl]hept-2-en-4-yn-1-amine; (E)-3-[(3,3'-Bithiophen)-5-ylmethoxy]-N-(6,6-dimethyl-2-hepten-4-ynyl)-N-ethylbenzylamine; NB598.

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~50 mg/mL (~111.19 mM)

配方 1 中的溶解度: 2.5 mg/mL (5.56 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.56 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。