NLRP3

在纳摩尔剂量下，MCC950 可防止传统和非规范的 NLRP3 激活。 MCC950 不会特异性抑制 AIM2、NLRC4 和 NLRP1 的激活，而 NLRP3 则会被抑制。使用小鼠骨髓源性巨噬细胞 (BMDM) 和人单核细胞源性巨噬细胞 (HMDM)，研究了 MCC950 对 NLRP3 炎性体激活的影响。 MCC950 在 BMDM 中表现出约 7.5 nM 的抑制能力，在 HMDM 中表现出约 8.1 nM 的抑制能力。此外，MCC950 以剂量依赖性方式减少 IL-1β 分泌，但不减少 TNF-α 分泌。 MCC950 首先刺激非经典途径，然后选择性抑制 caspase-11 介导的 NLRP3 激活和 IL-1β 释放。即使剂量为 10 µM，MCC950 也无法抑制鼠伤寒沙门氏菌诱导的 NLRC4 刺激的 IL-1β 和 TNF-α 产生。 MCC950 对鼠伤寒沙门氏菌响应的 IL-1β 或 caspase-1 激活过程没有影响。 MCC950 处理不会对细胞裂解物中的 pro-caspase-1 和 pro-IL-1β 产生显着影响 [1]。

MCC950 可减轻实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE)（一种多发性硬化症疾病模型）的严重程度，并减少白介素-1p (IL-1β) 的产生。 MCC950 预处理可降低 IL-1β 和 IL-6 的血清浓度，但不会显着降低 TNF-α 水平。 MCC950 治疗可减轻小鼠 EAE 的严重程度并推迟其发展。将 MCC950 处理的动物与 PBS 处理的小鼠进行比较时，第 22 天处死小鼠的脑单核细胞的细胞内细胞因子标记和 FACS 分析显示，产生 IL-17 和 IFN-γ 的 CD3+ T 细胞的频率略低。产生 IFN-γ 的 CD3+ T 细胞的 CD4+ 和 γδ+ 亚群数量减少，特别是产生 IL-17 的细胞[1]。

炎症小体活化测定[1]
将BMDM以5×0 105/ml或1×0 6/ml接种，HMDM以5倍10 5/ml接种，PBMC以2×10 6/ml或5×0 6 g/ml接种于96孔板中。第二天，更换过夜培养基，并用来自大肠杆菌血清型EH100（ra）TLRgrade™的10 ng/ml LPS刺激细胞3小时。取出培养基，用含有二甲基亚砜（1:1000）、MCC950（0.001-10µM）、格列本脲（200µM），孤雌内酯（10µM）或拜耳半胱氨酰白三烯受体拮抗剂1-（5-羧基-2{3-[4-（3-环己基丙氧基）苯基]丙氧基}苯甲酰基）哌啶-4-羧酸（40µM）的无血清培养基（SFM）代替。然后用炎症小体激活剂刺激细胞30分钟：5 mM腺苷5’-三磷酸二钠盐水合物（ATP）（1小时）、用Lipofectamine 2000™（Invitrogen）转染的1µg/ml聚脱氧腺苷酸胸苷酸钠盐（Poly dA:dT）（3-4小时）、200µg/ml MSU（过夜）和10µM尼格瑞金（1小时。细胞也用25µg/ml聚腺苷酸-多ridylic acid刺激（4小时）。对于非典型炎症小体激活细胞，用100 ng/ml Pam3CSK4引发4小时，移除培养基并用含有DMSO或MCC950的SFM代替，并使用0.25%FuGENE®转染2µg/ml LPS 16小时。根据制造商的说明，移除上清液并使用ELISA试剂盒分析。使用Cytox96®非放射性细胞毒性测定法测量LDH释放。[1]

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飞行时间炎症小体评估（TOFIE）测定[1]
使用Lipofectamine 2000™在24孔板中用以下质粒转染HEK293T细胞（4×105/ml）：pEF6人ASC-GFP、pEF6人类C-mCherry或空载体对照。转染后1小时，用DMSO或MCC950（0.1–50µM）处理细胞。将转染后15小时的细胞移除并悬浮在含有1%FCS和2mM EDTA的DPBS中。使用Gallios™流式细胞仪和FlowJo软件对细胞进行分析。在GFP和Cherry表达上对活细胞进行门控（当共转染时）。通过分析GFP脉冲区域的高度和宽度（低宽度：区域和高高度：区域）来确定含有ASC斑点的细胞的百分比。Sester et al。

蛋白质印迹[1]
通过在50µl 5中直接裂解制备细胞裂解物ィ 莱姆利样品缓冲液。根据制造商的说明，使用StrataClean™树脂浓缩上清液的蛋白质含量。将蛋白质样品在15%SDS-PAGE凝胶上解析，并使用湿转移系统转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。在室温（RT）下，将膜封闭在TBS-T（50mM Tris/HCL，pH 7.6，150mM NaCl和0.1%（v/v）Tween-20）中的5%（w/v）奶粉中1小时。将膜与稀释在TBS-T中的5%（w/v）奶粉中的一级抗体一起孵育，然后与适当的辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二级抗体在TBS-T中稀释在5%（w/v）奶粉中孵育1小时。使用20ィ LumiGLO®化学发光试剂。在重新处理之前，使用Restore™PLUS蛋白质印迹剥离缓冲液剥离膜。[1]
将患有CAPS的个体的PBMC以2×0 106/ml的剂量接种在12孔板中，然后用1µg/ml LPS预处理3小时。用含有MCC950（5–1000 nM）的SFM代替培养基。45分钟后，收集细胞培养上清液和细胞裂解物。使用Novex®Tris-Glycine凝胶系统解析样品。[1]

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荧光成像平板阅读器（FLIPR）Ca2+分析[1]
将BMDM（3×104/孔）在37°C下用不洗涤的钙染料（Molecular Devices）在含有0.1%BSA的生理盐水溶液（PSS；成分NaCl 140 mM，葡萄糖11.5 mM，KCl 5.9 mM，MgCl2 1.4 mM，NaH2PO4 1.2 mM，NaHCO3 5 mM，CaCl2 1.8 mM，HEPES 10 mM）中加载30分钟。然后将细胞转移到FLIPRETTRA荧光板读取器上，并使用冷却的CCD相机测量Ca2+响应，激发为470–495 nM，发射为515–575 nM。调节每个板的相机增益和强度，以产生至少1000个任意荧光单位（AFU）的基线荧光。在添加MCC950之前，采集10个基线荧光读数，然后在添加样品后300秒内每秒读取荧光读数，并在添加PSS或ATP（500µM）后再读取300秒。

In vivo LPS challenge[1]
C57BL/6 mice were injected intraperitoneally (i.p.) with 50 mg/kg MCC950 or vehicle control (DMSO/PBS) 1 h h before i.p. injection of 10 mg/kg LPS Escherichia coli 055:B5 or PBS. After for 2 h mice were sacrificed and serum levels of IL-1β, TNF-α and IL-6 were measured by ELISA.[1]

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Induction and Assessment of EAE[1]
C57BL/6 mice were immunized subcutaneously with 150 µg of MOG peptide 35–55 (GenScript) emulsified in CFA containing 4 mg/ml (0.4.mg/mouse) of heat-killed MTB (Chondrex). Mice were injected i.p. with 500 ng pertussis toxin (PT: kaketsuken) on days 0 and 2. MCC950 was administered i.p. to mice (10 mg/kg) at induction of the disease, day 0, 1 and 2 and every 2 days thereafter. Control mice were administered vehicle (PBS) at the same time points. Mice were observed for clinical signs of disease daily (unblinded). Disease severity was scored as follows: no clinical signs, 0; limp tail, 1; ataxic gait, 2; hind limb weakness, 3; hind limb paralysis, 4; and tetra paralysis, 5., Experiments were performed under license (BI00/2412) from The Irish Medicine Board and with approval from the Trinity College Dublin BioResources Ethics Committee.[1]

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FACS analysis of EAE[1]
On day 22 post immunization mononuclear cells were isolated from whole brains of perfused mice with EAE, following homogenisation and centrifugation on a Percoll gradient. Mononuclear cells (MNC) (2 × 106/ml) were stimulated for 4 h with PMA (10 ng/ml) and ionomycin (1 µg/ml) in the presence of brefeldin A (5 µg/ml). Cells were washed in PBS and re-suspended in 50 µL PBS with 1:1,000 LIVE/DEAD® Fixable Aqua Dead Cell Stain kit for 20 min. Surface stains for CD3 (145-2c11) (0.5 µl/106 cells), CD4 (RM4-5) (0.5 µl/106 cells) and γδ TCR (GL3) (1 µl/106 cells) (eBioscience) were added and cells were incubated for a further 20 mins. Cells were then fixed with 2% paraformaldehyde and washed in PBS twice, before being intracellularly stained for IL-17 or IFN-γ in permeabilization buffer (0.2% saponin in PBS + 1% FBS). Flow cytometric analysis of MNC was performed using a BD LSRFortessa™ and analysed with FlowJo software. MNC were first gated on live CD3+ T cells followed by CD4 expression, γδ TCR expression or cytokine production.[1]

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NLRP3 and NLRP1 activating mutation mice[1]
Mice were backcrossed to C57BL/6 at least ten times. Nlrp3A350VneoR mice were provided by Hal M. Hoffman, The University of California, San Diego, U.S.A. and crossed with LysMCre mice (B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J. MCC950 was administered i.p. (20 mg/kg) every second day starting at day 4 after birth. Mice with an activating mutation in NLRP1, Nlrp1aQ593P were generated on a C57BL/6 background as described previously and administered MCC950 i.p. (20 mg/kg) every second day for 9 days. Blood was collected at the timepoints indicated for analysis of plasma cytokines by ELISA. IL-18 ELISA was performed as described by Westwell-Roper et al. Experiments were performed under AEC Project 2013.011 and were approved by the Animal Ethics Committee of The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research.

[1]. Coll RC, et al. A small-molecule inhibitor of the NLRP3 inflammasome for the treatment of inflammatory diseases. Nat Med. 2015 Mar;21(3):248-55

C20H24N2O5S

404.48

404.14059

210826-40-7

MCC950 sodium;256373-96-3

White to light yellow solid

3.2

106Ų

O=S(C1=CC(C(C)(O)C)=CO1)([N-]C(NC2=C3CCCC3=CC4=C2CCC4)=O)=O

LFQQNXFKPNZRFT-UHFFFAOYSA-M

InChI=1S/C20H24N2O5S.Na/c1-20(2,24)14-10-17(27-11-14)28(25,26)22-19(23)21-18-15-7-3-5-12(15)9-13-6-4-8-16(13)18;/h9-11,24H,3-8H2,1-2H3,(H2,21,22,23);/q;+1/p-1

sodium;1,2,3,5,6,7-hexahydro-s-indacen-4-ylcarbamoyl-[4-(2-hydroxypropan-2-yl)furan-2-yl]sulfonylazanide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.18 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.18 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.18 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。