Ferroptosis (IC50 = 22 nM)

在小鼠胚胎成纤维细胞中，lipostatin-1 具有抗铁死亡作用，IC50 约为 38 nM[2]。Fer1和Lip-1 (lipostatin-1)天生是好的，但不是很好的，自由基捕获抗氧化剂；fe -1和Lip-1是磷脂双层中优异的自由基捕获抗氧化剂fer1和Lip-1充其量是15-LOX-1的不良抑制剂，α-TOH也是如此。[2] <人力资源> Lipostatin-1 治疗能够保护HRPTEpiCs免受rsl3诱导的细胞死亡，这支持了铁凋亡的参与。在永生化的人肾近端小管上皮细胞系HK-2中也获得了类似的结果。接下来，我们使用sirna库敲除HK-2细胞中的Gpx4，揭示了对αToc处理敏感的细胞活力虽小但显著下降（补充图7c）。然而，由于Gpx4在肾小管上皮细胞中的高表达水平，通过敲低Gpx4诱导细胞死亡被证明是具有挑战性的（补充图7d）。尽管如此，Gpx4敲低使细胞对铁致凋亡诱导剂更敏感（补充图7e），表明Gpx4调节的铁致凋亡机制在人类近端小管上皮细胞中起作用。此外，rsl3诱导的BODIPY 581/591 C11氧化可以被Liproxstatin-1阻断（图7b），这表明Liproxstatin-1也可以阻止人类铁致细胞死亡[1]。

在人类细胞、Gpx4/肾脏和缺血/再灌注诱导的组织损伤模型中，liprostatin-1（10 mg/kg，腹腔注射）可减少铁死亡[1]。
接下来，研究人员评估了liprostatin-1在动物体内预防诱导性Gpx4破坏后果的潜力。在对CreERT2；Gpx4fl/fl小鼠进行TAM治疗时，小鼠每天腹腔注射liprostatin-1，直到小鼠出现急性肾功能衰竭（ARF）的迹象，此时它们被安乐死（图7c）。值得注意的是，与药物治疗组相比，liprostatin-1显著延长了生存期。TAM处理后第9天的TUNEL染色显示，与药物处理组相比，liprostatin-1中TUNEL+细胞数量明显减少（图7d），表明liprostatin-1延缓了小管细胞的铁凋亡。图1c中ARF引起的小鼠死亡与图7c中药物处理动物死亡的差异可以用TAM给药方式来解释，即喂食与注射。 作为一项独立的概念验证，我们分析了liprostatin-1在肝脏缺血/再灌注损伤真实模型中的体内疗效，提供了liprostatin-1减轻缺血/再灌注肝损伤组织损伤的证据（图7e）。因此，这些数据暗示铁下垂是缺血/再灌注诱导的组织损伤的一个因素，并为治疗相关病理的治疗方法的开发带来了巨大的希望。[1]

苯乙烯的自氧化抑制[2]
这些实验是以类似于我们在以前的工作中所描述的方式进行的简而言之，苯乙烯用1m NaOH水溶液洗涤三次，在MgSO4上干燥，过滤，真空蒸馏，通过二氧化硅渗透纯化，然后是碱性氧化铝。在1.25 mL苯乙烯的比色皿中加入1.18 mL氯苯，在37℃下平衡5min。空白试管，在1,2,4-三氯苯中加入12.5 μL 2 mM PBD-BODIPY，再加入50 μL 0.3 M氯苯AIBN，充分混合。20min后，加入liprostatin-1、fe -1、C15-THN、PMHC或α-TOH原液（1mm）的氯苯溶液，在591 nm处失去吸光度。每个实验的抑制速率常数（kinh）和化学计量(n)根据图1B确定（完整细节见辅助信息）。在每个浓度下进行三次技术重复的自氧化，动力学以平均值±标准差报告。

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抑制PC脂质体的自氧化作用[2]
在2.34 mL pH为7.4的10 mM PBS培养皿中加入脂质体（pH为7.4的20 mM PBS中125 μL），在37℃下平衡5min。空白试管，在DMSO中加入10 μL 2 mM的STY-BODIPY，然后在乙腈中加入10 μL 0.05 M的MeOAMVN，充分混合。5 min后，加入liprostatin-1、fe -1、C15-THN、PMHC或α-TOH原液（1 mM），在DMSO中测定565 nm处吸光度损失。根据图3B测定每个实验的抑制速率常数（kinh）和化学计量学(n)（见附图（完整细节见附图））。在每个浓度下进行三次技术重复的自氧化，动力学以平均值±标准差报告。在脂质体挤出前添加抗氧化剂的选择对照实验中获得了难以区分的结果。

Ferroptosis抑制剂的表型筛选[1]
简而言之，将化合物播种到96孔板上（每孔1000个细胞），同时给药1 μM TAM（导致Gpx4失活），避免多次更换培养基，然后孵育72小时。随后使用活/死实验染料AquaBluer评估细胞活力。在第一轮筛选中，所有化合物在10 μM的单一浓度下进行测试，并从细胞存活率>80%的井中选择阳性命中。为了确认最初的命中，在相同的实验中重新筛选化合物，并在0-100 μM的浓度下获得剂量依赖性生存和毒性曲线。采用GraphPad Prism软件计算IC50和TC50值。然后根据疗效、对ferroptosis的选择性、治疗范围和物理化学性质对验证命中进行评估。此外，还进行了计算机ADME-Tox筛选，以排除具有潜在体内副作用的化合物。为了进一步验证liprostatin-1，使用市售衍生物进行了SAR研究。

Animals included in the treatment study of inducible Gpx4−/− mice were equally distributed between sex and weight, with typically 8–10 weeks of age. The average weight within the groups was between 22 and 24 g. Groups were formed to have comparable numbers of females/males of the same age. Animal weight was arranged to have a similar distribution between females and males. For the pharmacological inhibitor experiments, CreERT2;Gpx4fl/fl mice were injected on day 1 and 3 with 0.5 mg TAM dissolved in Miglyol. On day 4, compound treatment was started (liprostatin-1: 10 mg kg−1) along with vehicle control (1% dimethylsulphoxide (DMSO) in PBS). Liproxstatin-1 and vehicle control were administered once daily by i.p. injection. Survival analysis was performed using the GraphPad Prism software and statistical analysis was done according to the log-rank (Mantel–Cox) test. The compounds, vehicle and liprostatin-1, were both odourless and colourless ensuring no detectable bias. Injections and daily animal assessment were performed in a blinded fashion. When animals showed terminal signs, they were euthanized. No statistical method was used to predetermine sample size for the treatment of the Gpx4−/− mice. Mice were kept under standard conditions with food and water ad libitum (ssniff). All experiments were performed in compliance with the German Animal Welfare Law and have been approved by the institutional committee on animal experimentation and the government of Upper Bavaria.[1]

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Dissolved in % DMSO in PBS; 10 mg/kg; i.p. injection

GreERT2; Gpx4fI/fI mice

In addition, we assessed important ADME (absorption, distribution, metabolism and excretion) parameters (Table 1), indicating a very promising pharmacokinetic profile for Liproxstatin-1. In summary, the initial SAR results provide the rationale for further improvement of Liproxstatin-1 by medicinal chemistry.[1]

[1]. Inactivation of the ferroptosis regulator Gpx4 triggers acute renal failure in mice. Nat Cell Biol. 2014 Dec;16(12):1180-91.

[2]. On the Mechanism of Cytoprotection by Ferrostatin-1 and Liproxstatin-1 and the Role of Lipid Peroxidation in Ferroptotic Cell Death. ACS Cent Sci. 2017 Mar 22;3(3):232-243.

Liproxstatin-1 is an azaspiro compound that is 1'H-spiro[piperidine-4,2'-quinoxaline] in which the hydrogen at position 3' is replaced by a (3-chlorobenzyl)amino group. It is a potent inhibitor of ferroptosis. It has a role as a ferroptosis inhibitor, a radical scavenger, an antioxidant and a cardioprotective agent. It is a member of monochlorobenzenes, a secondary amino compound, an azaspiro compound and an organic heterotricyclic compound.

C19H21CLN4

340.85

340.145

C, 66.95; H, 6.21; Cl, 10.40; N, 16.44

950455-15-9

Liproxstatin-1 hydrochloride;2250025-95-5;Liproxstatin-1-13C6;Liproxstatin-1-15N

135735917

White to off-white solid powder

1.3±0.1 g/cm3

581.4±50.0 °C at 760 mmHg

305.4±30.1 °C

0.0±1.6 mmHg at 25°C

1.678

2.67

48.4

3

3

2

24

460

0

YAFQFNOUYXZVPZ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H21ClN4/c20-15-5-3-4-14(12-15)13-22-18-19(8-10-21-11-9-19)24-17-7-2-1-6-16(17)23-18/h1-7,12,21,24H,8-11,13H2,(H,22,23)

N-[(3-Chlorophenyl)methyl]-spiro[piperidine-4,2′(1′H)-quinoxalin]-3′-amine

Liproxstatin-1; 950455-15-9; Liproxstatin 1; Lip-1; liproxstatin1; N-(3-Chlorobenzyl)-1'H-spiro[piperidine-4,2'-quinoxalin]-3'-amine; CHEBI:173097; N-[(3-CHLOROPHENYL)METHYL]-1'H-SPIRO[PIPERIDINE-4,2'-QUINOXALIN]-3'-AMINE;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.33 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.33 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.33 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.33 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 5 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.33 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 95% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 6 中的溶解度: ≥ 0.5 mg/mL (1.47 mM) (饱和度未知) in 1% DMSO 99% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。