EGFR (IC50 = 29 nM); BRaf^V600E (IC50 = 23 nM); EGFR^L858R/T790M (IC50 = 495 nM)

体外活性：BGB-283 在体外有效抑制 BRAFV600E 激活的 ERK 磷酸化和细胞增殖。它具有选择性细胞毒性，并优先抑制携带 BRAFV600E 和 EGFR 突变/扩增的癌细胞的增殖。在 BRAFV600E 结直肠癌细胞系中，BGB-283 有效抑制 EGFR 的再激活和 EGFR 介导的细胞增殖。它表现出对含有 BRAFV600E 或 EGFR 突变的细胞系的选择性细胞毒性。 BGB-283 以剂量依赖性方式抑制 A431 细胞中 EGF 诱导的 Tyr1068 上的 EGFR 自磷酸化。在WiDr结直肠癌细胞中，BGB-283被证明能够抑制EGFR信号传导的反馈激活，并实现对pERK的持续抑制。激酶测定：在生化测定中，Lifirafenib (BGB-283) 抑制 RAF 激酶和 EGFR 活性，对于重组 BRAFV600E 激酶结构域、EGFR 和 EGFR T790M/L858R 突变体的 IC50 值为 23、29 和 495 nM。在基于时间分辨荧光共振能量转移 (TR-FRET) 方法的测定中，测试了化合物对 RAF 和 WT EGFR 激酶活性的抑制作用。 MEK1 (K97R) 用作 RAF 激酶的底物，生物素化肽底物用作 EGFR (61TK0BLC, CisBio Bioassys)。将激酶与连续稀释的化合物在室温 (RT) 下孵育 60 至 120 分钟，添加 ATP（终浓度为 100 μmol/L）和激酶底物以引发反应。根据制造商说明（CisBio Bioassays）通过等体积的终止/检测溶液来终止反应。将板密封并在室温下孵育 2 小时，并在 PHERAstar FS 读板器 (BMG Labtech) 上记录 TR-FRET 信号（665 nm 处的荧光发射与 337 nm 波长激发下的 620 nm 处发射的比率）。 Life Technologies 使用其在 ATP 浓度 Km 浓度下的标准测定法，对 BGB-283 在 10 μmol/L 固定浓度下的一组 277 种激酶中的活性进行了筛选。然后测定在 10 μmol/L BGB-283 下显示 >80% 抑制作用的激酶的 IC50。细胞测定：使用基于 TR-FRET 的方法测量细胞磷酸-ERK 和磷酸-EGFR。将细胞按 3 × 104 个/孔接种到 96 孔板中，并贴壁 16 小时。然后用 100 μL 不含血清的 DMEM 替换生长培养基。然后用化合物的10点滴定处理细胞。化合物处理1小时后，向每孔添加50μL裂解缓冲液(Cisbio)。然后将板在室温下摇动孵育30分钟。将 96 孔板每孔总共 16 μL 的细胞裂解液转移至 384 孔小体积白色板。将每孔的裂解物与 2 μL Eu3+- 或 Tb3+- 穴状化合物（供体）标记的抗 ERK 或抗 EGFR 抗体 (Cisbio) 和 2 μL D2（受体）标记的抗磷酸-ERK 或抗磷酸-一起孵育。 EGFR 抗体 (Cisbio) 室温 2 小时。使用 PHERAstar FS 读数器 (BMG Labtech) 测量 FRET 信号。

BGB-283 治疗可导致剂量依赖性肿瘤生长抑制，并伴有 BRAFV600E 突变的细胞系来源和原代人结直肠肿瘤异种移植物的部分和完全肿瘤消退。 BGB-283 在 BRAF(V600E) 结直肠癌异种移植模型中非常有效，包括 HT29、Colo205 和两种带有 BRAFV600E 突变的原发肿瘤异种移植模型。此外，BGB-283 在 WiDr 异种移植模型中显示出引人注目的功效，其中 BRAF 抑制后可诱导 EGFR 再激活。 BGB-283 可诱导 HCC827 中的肿瘤消退，但不会诱导 A431 异种移植物中的肿瘤消退。 BGB-283 抑制 ERK1/2 和 EGFR 的磷酸化，并在 WiDr 肿瘤异种移植物中显示出有效的抗肿瘤活性。 BGB-283 不会诱导 EGFR 反馈激活，如维莫非尼报道的那样。重复给药时，BGB-283 可有效抑制体内 MEK 和 ERK 磷酸化以及 DUSP6 表达。 AKT 磷酸化没有可检测到的差异。

在生化检测中，lifafenib (BGB-283) 抑制 EGFR 和 RAF 激酶，对于 EGFR、EGFR T790M/L858R 突变体和重组 BRAFV600E 激酶结构域的 IC50 值为 23、29 和 495 nM。使用时间分辨荧光共振能量转移 (TR-FRET) 测定，检查化合物抑制 WT 和 RAF 中 EGFR 激酶活性的能力。对于 RAF 激酶，采用 MEK1 (K97R) 作为底物，对于 EGFR，采用生物素化肽底物（61TK0BLC，CisBio Bioassys）。在室温 (RT) 下连续化合物稀释孵育 60 至 120 分钟后，将最终浓度为 100 mol/L 的 ATP 和激酶底物添加到激酶中。根据制造商的说明（CisBio Bioassays），用等体积的终止/检测溶液终止反应。将板密封并在室温下孵育两小时后，使用 PHERAstar FS 读板器 (BMG Labtech) 记录 TR-FRET 信号，即 665 nm 处的荧光发射与激发时 620 nm 处的发射的比率波长为 337 nm。 Life Technologies 使用其在 Km ATP 浓度下的标准测定法来筛选 BGB-283，以筛选 BGB-283 在 10 μmol/L 固定浓度下在一组 277 种激酶中的活性。然后通过计算 IC50 来鉴定在 10 μmol/L BGB-283 下表现出 >80% 抑制的激酶。

对于每个细胞系，96 孔板每孔接种的细胞数量经过优化，以保证在三天的治疗期间实现对数生长。 16 小时贴壁期后，对重复细胞进行 10 点系列稀释。化合物暴露三天后，添加与每孔中细胞培养基体积相等的 CellTiter-Glo 试剂。将混合物在定轨摇床上混合两分钟以使细胞裂解后，将混合物在室温下放置十分钟以产生并稳定发光信号。光度信号被量化。

Mice: Mice are randomized to treatment groups when the average tumor size reaches 110 to 200 mm3. Treatments consist of oral gavage (p.o.) with vehicle alone or 2.5 to 30 mg/kg of BGB-283 administered twice daily or once daily. Mice given either cetuximab (40 mg/kg twice weekly) or erlotinib (100 mg/kg qd) are used as controls. Erlotinib and ligofenib (BGB-283) are combined to form a homogenous suspension at the required concentration in 0.5% (w/v) methylcellulose in purified water. Before administering, the injection solution for cetuximab is diluted with saline.

[1]. BGB-283, a Novel RAF Kinase and EGFR Inhibitor, Displays Potent Antitumor Activity in BRAF-Mutated Colorectal Cancers. Mol Cancer Ther. 2015 Oct;14(10):2187-97.

Lifirafenib is under investigation in clinical trial NCT03641586 (The Study of BGB-283 in Chinese Subjects With Local Advanced or Metastatic Malignant Solid Tumor).
Lifirafenib is an inhibitor of the serine/threonine protein kinase B-raf (BRAF) and epidermal growth factor receptor (EGFR), with potential antineoplastic activity. Lifirafenib selectively binds to and inhibits the activity of BRAF and certain BRAF mutant forms, and EGFR. This prevents BRAF- and EGFR-mediated signaling and inhibits the proliferation of tumor cells that either contain a mutated BRAF gene or express over-activated EGFR. In addition, BGB-283 inhibits mutant forms of the Ras proteins K-RAS and N-RAS. BRAF and EGFR are mutated or upregulated in many tumor cell types.

C25H17F3N4O3

478.42

478.125

C, 62.76; H, 3.58; F, 11.91; N, 11.71; O, 10.03

1446090-79-4

rel-Lifirafenib;1446090-77-2

89670174

White to off-white solid powder

5.433

89.13

2

8

3

35

845

3

FC(C1C([H])=C([H])C2=C(C=1[H])N([H])C([C@]1([H])[C@]3([H])[C@@]1([H])C1C([H])=C(C([H])=C([H])C=1O3)OC1C([H])=C([H])N=C3C=1C([H])([H])C([H])([H])C(N3[H])=O)=N2)(F)F

NGFFVZQXSRKHBM-FKBYEOEOSA-N

InChI=1S/C25H17F3N4O3/c26-25(27,28)11-1-4-15-16(9-11)31-24(30-15)21-20-14-10-12(2-5-17(14)35-22(20)21)34-18-7-8-29-23-13(18)3-6-19(33)32-23/h1-2,4-5,7-10,20-22H,3,6H2,(H,30,31)(H,29,32,33)/t20-,21-,22-/m0/s1

5-[[(1R,1aS,6bR)-1-[6-(trifluoromethyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-1a,6b-dihydro-1H-cyclopropa[b][1]benzofuran-5-yl]oxy]-3,4-dihydro-1H-1,8-naphthyridin-2-one

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.23 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.23 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。