GW6471

PPARα

在基于细胞的基因报告基因测试中，GW6471 显着降低 GW409544 诱导的 PPARα 激活，IC50 为 0.24 μM [1]。使用 MTT 测定，评估 PPARα 对肾细胞癌 (RCC) 细胞活力的功能影响。在 72 小时的持续时间内，使用特定 PPARα 选择性拮抗剂 GW6471 或特定 PPARα 激动剂 WY14,643 以 12.5 剂量范围内的剂量对 Caki-1（VHL 野生型）和 786-O（VHL 突变型）细胞进行无菌处理。至 100 μM。然后评估细胞的活力。 WY14,643 不会影响细胞活力或导致细胞活力逐渐增加，但 GW6471 以足依赖性方式显着降低两种细胞系的细胞活力，高达近 80% [2]。

使用肿瘤皮下异种移植模型评估 PPARα 拮抗剂的体内抗活性。裸鼠（Nu/Nu）皮下注射 Caki-1 细胞。药物 GW6471 每天腹腔注射，持续四个星期，剂量为 20 毫克/千克小鼠体重，在体内剂量反应研究中发现，一旦肿瘤块生长到直径，该药物是有效的，并在此得到验证大约5毫米。用GW6471治疗的动物和用媒介物治疗的动物的肿瘤生长存在显着差异。动物体重表明GW6471剂量没有毒性，肝肾功能测试等实验室结果也没有显示负面影响。通过评估肿瘤中的 c-Myc 水平来说明 GW6471 的抑制作用，结果表明接受 GW6471 治疗的动物的肿瘤显着减少 [3]。

结合测定[1]
使用Packard BioScience30的AlphaScreen技术，通过化学介导的荧光能量转移测定测定GW6471对共激活肽和共抑制肽与PPARα相互作用的影响。实验用5 含有单个基序的生物素化肽的nM PPARαLBD（图3a），按照制造商关于六组氨酸检测试剂盒的说明，在含有50 mM MOPS，pH 7.4，50 mM NaF，0.05 mM CHAPS，0.1 毫克 ml-1牛血清白蛋白和10 mM二硫苏糖醇（DTT）。随着GW6471浓度的增加，检测到结合信号，并将四个重复实验的结果标准化为不存在GW6471时结合的百分比。
GW6471对SMRT或N-CoR肽与纯化的PPARαLBD的亲和力的影响通过在含有10 mM HEPES，pH 7.4，0.15 M NaCl，3 mM EDTA，0.005%聚山梨醇酯-20，5 mM DTT和2.5%DMSO。在存在或不存在40的情况下PPARαLBD的不同浓度 µM GW6471在室温下与10 nM的N-CoR2或SMRT2的荧光素标记的肽（图第3a段）。使用具有485的BMG PolarStar Galaxy荧光读取器测定每种受体浓度的荧光偏振值 nm激发和520 nm发射滤光片。表观离解常数（Kd）值由结合曲线确定，结合曲线源自简单1:1相互作用的数据的非线性最小二乘拟合
SMRT共阻遏物基序与PPARα和TRβLBD相互作用的突变分析也通过荧光偏振进行。为了确定SMRT基序中每个氨基酸与核受体结合的重要性，添加在每个位置具有丙氨酸取代的SMRT肽以抑制1 µM TRβLBD或2 µM PPARα与荧光N-CoR2肽结合。对于PPARα实验，我们添加了10 µM GW6471。构建抑制曲线，并通过数据与简单1:1相互作用的非线性最小二乘拟合来确定IC50值。

如前所述，使用（UAS）5-tk-SPAP报告子和人PPARα-GAL4嵌合体在CV-1细胞中进行GW6471作为拮抗剂的基于细胞的测定11。我们使用lipofectamine和β-半乳糖苷酶载体进行转染，作为标准化对照。哺乳动物的两种杂交测定是根据已公布的程序29进行的。包括8种转染混合物 ng（UAS）5-tk-CAT报告质粒，8 ng VP16人PPARα表达质粒，2 GAL4–N-CoR或GAL4–SMRT表达质粒的ng，25 ngβ-半乳糖苷酶表达质粒作为内部对照，和35 ng载体质粒。GW6471和GW409544的合成将在别处描述。

---

肾细胞癌（RCC）是美国第六常见的癌症。虽然肾细胞癌具有高度转移性，但转移性肾细胞癌患者几乎没有治疗选择，即使使用最新的靶向治疗方法，患者的无进展生存期也只有两年。因此，迫切需要针对这种疾病的新的治疗靶点。基于我们之前的代谢组学研究，显示在RCC患者和异种移植物小鼠材料中过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）相关事件的改变，本研究在RCC环境中进一步检查了这一途径。PPARα是一种核受体蛋白，作为基因的转录因子发挥作用，包括编码参与能量代谢的酶的基因；虽然PPARα已被报道在几种癌症中调节肿瘤生长，但尚未在RCC中进行评估。特异性PPARα拮抗剂GW6471在VHL（+）和VHL（-）RCC细胞系（786-O和Caki-1）中诱导细胞凋亡和G0/G1细胞周期停滞，与细胞周期调节蛋白c-Myc、细胞周期蛋白D1和CDK4的减弱有关；通过siRNA方法证实该数据对PPARα拮抗具有特异性。有趣的是，当糖酵解被几种方法阻断时，GW6471的细胞毒性协同增加，这表明糖酵解转变为脂肪酸氧化，并为RCC提供了一种全新的治疗方法。

All animal procedures were performed in compliance with the University of California Animal Care and Use Committee. Male athymic Nu/Nu mice (8 wk of age, ∼25 g body wt) were injected with 1 × 105 Caki-1 cells subcutaneously (3:1 DMEM-Matrigel) in the flank region. Tumor progression was monitored weekly by calipers using the following formula: tumor volume (in mm3) = (length × width2)/2. When tumor size reached ∼80–100 mm3, animals were randomly assigned to four groups and treatments were started (day 1). The vehicle group received DMSO (4% in PBS) intraperitoneally and vegetable oil via oral gavage. The PPARα group was injected intraperitoneally with GW6471 in the same vehicle [20 mg/kg body wt; murine dose response is reported elsewhere] every other day. The sunitinib group received sunitinib in vegetable oil via oral gavage (40 mg/kg body wt) 5 days/wk. Another group received GW6471 + sunitinib as described above. To determine any potential toxicity of the treatment(s), body weights of the animals were measured and signs of adverse reactions were monitored. On day 28, the mice were euthanized and the tumor mass was determined. Tumor growth rate was calculated as follows: tumor volume on day x/tumor volume on day 1. Serum samples collected from mice at the end of the experiment were analyzed using the Roche cobas c501 analyzer (6000 series) at Clinical Diagnostic Laboratories in the University of California, Davis, using the Small Animal Chem 2 panel. Frozen tumor tissues were also collected at the end of the experiment and homogenized and extracted in T-PER for c-Myc quantification by Western blotting.[3]

[1]. Structural basis for antagonist-mediated recruitment of nuclear co-repressors by PPARalpha. Nature. 2002 Feb 14;415(6873):813-7.

[2]. Inhibition of PPARα induces cell cycle arrest and apoptosis, and synergizes with glycolysisinhibition in kidney cancer cells. PLoS One. 2013 Aug 7;8(8):e71115.

[3]. PPARα inhibition modulates multiple reprogrammed metabolic pathways in kidney cancer and attenuates tumor growth. Am J Physiol Cell Physiol. 2015 Jun 1;308(11):C890-8.

C35H36F3N3O4

619.6733

619.265

C, 67.84; H, 5.86; F, 9.20; N, 6.78; O, 10.33

880635-03-0

446738

Light yellow to yellow solid

1.2±0.1 g/cm3

1.556

7.24

96.95

2

9

14

45

954

1

C(C1=C(C)OC(C2C=CC=CC=2)=N1)COC1C=CC(C[C@@H](CNC(=O)CC)N/C(/C)=C\C(C2C=CC(C(F)(F)F)=CC=2)=O)=CC=1

TYEFSRMOUXWTDN-DYQICHDWSA-N

InChI=1S/C35H36F3N3O4/c1-4-33(43)39-22-29(40-23(2)20-32(42)26-12-14-28(15-13-26)35(36,37)38)21-25-10-16-30(17-11-25)44-19-18-31-24(3)45-34(41-31)27-8-6-5-7-9-27/h5-17,20,29,40H,4,18-19,21-22H2,1-3H3,(H,39,43)/b23-20-/t29-/m0/s1

(S,Z)-N-(3-(4-(2-(5-methyl-2-phenyloxazol-4-yl)ethoxy)phenyl)-2-((4-oxo-4-(4-(trifluoromethyl)phenyl)but-2-en-2-yl)amino)propyl)propionamide

GW6471; GW-6471; GW 6471

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~83.33 mg/mL (~134.47 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.36 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: 2.08 mg/mL (3.36 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

---

View More

配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.36 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。