RIP1 kinase

体外活性：GSK-963（也称为 GSK963 或 GSK963）是一种有效的选择性 RIP1 激酶抑制剂。在生化和细胞测定中，GSK963 明显比 Nec-1（一种已知的 RIP1 激酶抑制剂）更有效，在人和小鼠细胞中抑制 RIP1 依赖性细胞死亡，IC50 介于 1 至 4 nM 之间。 GSK963 对 RIP1 的选择性比 339 种其他激酶高 10 000 倍，缺乏针对 IDO 的可测量活性，并且具有非活性对映体 GSK'962，可用于确认靶向效果。 GSK963 增强的体外效力也适用于体内，在 TNF 诱导的无菌休克模型中，GSK963 在与 Nec-1 匹配的剂量下提供了更大的低温保护。总之，我们相信 GSK963 代表了检查 RIP1 体外和体内功能的下一代工具，并应有助于澄清我们目前对 RIP1 在疾病发病机制中作用的理解。激酶测定：使用 ADP-Glo 发光测定测定化合物对抗 RIP1 激酶活性的效力，该测定如前所述测量 ATP 到 ADP 的转化。简而言之，主要反应由 50 mM HEPES pH 7.5、50 mM NaCl、30 mM MgCl2、1 mM DTT、0.5 mg/ml BSA 和 0.02% 中的 10 nM GST-RIPK1 (1–375) 和 50 μM ATP 组成章节。将 5 微升酶和 5 μl ATP 以最终测定浓度的两倍添加到板中，并在室温下孵育 4 小时。在读板器上测量发光。测试化合物抑制表示为内部测定对照的抑制百分比。细胞测定：在 caspase 抑制剂 zVAD-FMK 或 QVD-Oph 存在下，用 TNF 在 BMDM、L929 和 U937 细胞中诱导坏死性细胞死亡（BMDM：50 ng/ml TNF+50 μM zVAD；L929：100 ng/ml TNF） +50 μM QVD；U937：100 ng/ml TNF+25 μM QVD）。为了评估 RIP1 抑制剂的效果，用化合物（剂量反应）预处理细胞 30 分钟。 19-21小时后，通过使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定测量细胞ATP水平来评估诱导的细胞死亡。为了诱导中性粒细胞坏死性凋亡，用 TNF (10 ng/ml)、QVD-Oph (50 μM) 和 SMAC 模拟物 (100 nM) 刺激新鲜分离的人中性粒细胞。如上所述评估诱导的细胞死亡。

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GSK′963是TNF+zVAD介导的致死性休克的强效抑制剂：研究人员评估了GSK′965和Nec-1在体内腹腔注射后的药代动力学特征。尽管GSK′963的表观半衰期大于Nec-1（图3a；补充图1a），但Nec-1在10mg/kg时的暴露量比葛兰素史克′963高出约10倍。然而，基于小鼠药代动力学特征（图3a；补充图1a）和TNF+zVAD处理的L929细胞中的化合物效力（图2a）对这两种化合物的药效学建模表明，与Nec-1相比，在2 mg/kg的剂量下，GSK′963将在较长一段时间内将血液浓度维持在90%抑制RIP1活性所需的浓度以上（图3b；补充图1b）。为了直接在体内测试GSK′963的疗效，我们使用了无菌休克的急性模型。给予TNF+zVAD会导致致命的低体温，此前已被证明这取决于RIP1激酶活性。5,18用2 mg/kg GSK′963治疗动物可完全保护动物免受TNF+zVASD诱导的体温下降，0.2 mg/kg剂量也显示出显著的反应（图3c）。正如预期的那样，GSK'962对TNF+zVAD诱导的休克没有影响，证实GSK′963通过抑制RIP1激酶选择性地起作用（图3d）。有趣的是，Nec-1在0.2 mg/kg的剂量下对模型没有影响，该剂量在文献中通常用于在体内抑制RIP1，并且在高10倍的剂量下显示出最低水平的保护作用（图3e）。这些结果共同表明，与Nec-1相比，GSK′963是探索体内急性RIP1激酶生物学的更好工具分子[1]。

使用 ADP-Glo 发光测定法测定化合物对抗 RIP1 激酶活性的效力，该测定法测量 ATP 到 ADP 的转化，如前所述。简而言之，主要反应由 50 mM HEPES pH 7.5、50 mM NaCl、30 mM MgCl2、1 mM DTT、0.5 mg/ml BSA 和 0.02% 中的 10 nM GST-RIPK1 (1–375) 和 50 μM ATP 组成章节。将 5 微升酶和 5 μl ATP 以最终测定浓度的两倍添加到板中，并在室温下孵育 4 小时。在读板器上测量发光。测试化合物抑制表示为内部测定对照的抑制百分比。

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荧光偏振（FP）结合分析[1]
如前所述，开发了一种基于FP的结合测定法，通过与荧光标记的ATP竞争配体竞争，定量RIP1 ATP结合袋处新型测试化合物的相互作用。18简而言之，GST-RipK1（1-375）被纯化，并以10nM的最终测定浓度使用。使用荧光标记配体（14-（2-{[3-（{2-{[4-（氰甲基）苯基]氨基}-6-[（5-环丙基-1H-吡唑-3-基）氨基]-4-嘧啶基}氨基）丙基]氨基}-2-氧乙基）-16,16,18,18-四甲基-6,7,7a，8a，9,10,16,18-八氢苯并[2“，3”]中氮茚并[8“，7”：5ʹ，6ʹ;]吡喃并[3，2ʹ:3,4]吡啶并[1,2-A]吲哚-5-鎓-2-磺酸盐，最终测定浓度为5nM。样本在Analyst多模式阅读器上读取。试验化合物抑制率表示为内部试验对照的抑制百分比（%）。

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ADP-Glo激酶测定[1]
使用ADP-Glo发光测定法测定化合物对RIP1激酶活性的效力，该测定法测量ATP向ADP的转化，如前所述。18简而言之，主要反应由10 nM GST-RIPK1（1-375）和50μM ATP在50 mM HEPES pH 7.5、50 mM NaCl、30 mM MgCl2、1 mM DTT、0.5 mg/ml BSA和0.02%CHAPS中组成。将5微升酶和5μl ATP以最终测定浓度的两倍加入平板中，在室温下孵育4小时。在平板读数器上测量发光。试验化合物抑制率表示为内部测定对照的抑制百分比。

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激酶选择性[1]
在Reaction Corp Biology使用P33放射性标记测定法对GSK′963进行了抗339种激酶的测试(http://www.reactionbiology.com). 该化合物在10μM下以单次剂量进行了两次测试。反应在10μM ATP下进行。数据以酶活性百分比报告（相对于DMSO对照）。完整数据集见补充表一。

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IDO酶法测定[1]
如Takahashi等人25所述，使用购自R&D Systems的重组人IDO测定IDO活性。使用Spectramax酶标仪在490 nm下测量犬尿氨酸衍生的黄色色素。

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半胱天冬酶3/7测定[1]
为了诱导细胞凋亡，用GSK′963（100 nM）、GSK'962（100 nM）或Nec-1（10μM）预处理30分钟的BMDM用TNF（50 ng/ml）和CHX（12μg/ml）刺激。使用Caspase-Glo 3/7测定法在6小时时测量Caspase 3/7活性。

对于免疫印迹分析，用GSK'963 (100 nM)、GSK'962 (100 nM) 或 Nec-1 (10 μM) 预处理 30 分钟后，用 50 ng/ml TNF 刺激 BMDM 5 和 15 分钟。在 1× 细胞裂解缓冲液中用蛋白酶和磷酸酶抑制剂制成的裂解物在 4-12% SDS-PAGE 上分离，并印迹到硝酸纤维素膜上。 IκB、磷酸-IκB 和微管蛋白作为印迹上的上样对照进行探测。

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细胞培养[1]
将小鼠纤维肉瘤L929细胞（ATCC#CCL-1）和人单核细胞U937细胞在添加了10%热灭活FBS、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的RPMI培养基中培养。通过用10ng/ml M-CSF分化7天，从C57BL/6小鼠制备BMDM，并在添加了10%热灭活FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和0.25μg/ml两性霉素的DMEM培养基中培养。按照标准方法从人血液中分离出原代人中性粒细胞，该方法包括在右旋糖酐中顺序沉淀、在Ficoll-Hypaque中密度离心和溶解污染的红细胞。

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基于细胞的检测[1]
在半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂zVAD FMK或QVD Oph的存在下，TNF诱导BMDM、L929和U937细胞发生坏死性细胞死亡（BMDM:50 ng/ml TNF+50μM zVAD；L929:100ng/ml肿瘤坏死因子+50μM QVD；U937：100 ng/ml TNF+25μM QVD）。为了评估RIP1抑制剂的效果，用化合物（剂量反应）预处理细胞30分钟。19-21小时后，通过使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定法测量细胞ATP水平来评估诱导的细胞死亡。为了诱导中性粒细胞坏死性下垂，用TNF（10ng/ml）、QVD-Oph（50μM）和SMAC模拟物（100nM）刺激新鲜分离的人中性粒细胞。如上所述评估诱导的细胞死亡。

Pharmacokinetic experiments[1]
Briefly, pharmacokinetic studies were conducted using n=3 animals per group for each compound. Animals received either GSK′963 or 7-Cl-O-Nec-1 as an i.p. injection prepared as aqueous solutions in 6% 11-b-hydroxypropyl cyclodextrin and contained 5% DMSO. Blood samples were obtained at various time points following intraperitoneal injection and diluted 1 : 1 with water prior to storage at −80 °C.
Prior to bioanalysis, samples were thawed and each analyte was isolated using a method based on protein precipitation. The resulting supernatant was injected into an LC/MS/MS system optimized for detection of the compound of interest. Data were reported as quantitative drug concentrations as determined by standard calibration curve analysis. Using these optimized conditions, the typical lower limit of quantitation achieved was 1.00 ng/ml for both compounds.

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TNF+zVAD-induced shock model[1]
C57BL/6 mice were pretreated i.p. with Nec-1 (0.2 and 2 mg/kg), GSK′963 (0.2 and 2 mg/kg) or GSK′962 (20 mg/kg) 15 min prior to i.v. injection of TNF (1.25 mg/kg) and zVAD-FMK (16.7 mg/kg). Temperature was monitored over the course of 3 h by rectal probe.

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C57BL/6 mice were pretreated i.p. with Nec-1 (0.2 and 2 mg/kg), GSK′963 (0.2 and 2 mg/kg) or GSK′962 (20 mg/kg) 15 min prior to i.v. injection of TNF (1.25 mg/kg) and zVAD-FMK (16.7 mg/kg).

C57BL/6 mice

Researchers next assessed the pharmacokinetic profiles of GSK′963 and Nec-1 following intraperitoneal (i.p.) administration in vivo. Nec-1 demonstrated an ~10-fold higher exposure compared with GSK′963 at 10 mg/kg, although the apparent half-life of GSK′963 was greater than that for Nec-1 (Figure 3a; Supplementary Figure 1a). However, pharmacodynamic modeling of both compounds based on the mouse pharmacokinetic profiles (Figure 3a; Supplementary Figure 1a) and compound potencies in TNF+zVAD-treated L929 cells (Figure 2a) indicated that at 2 mg/kg, GSK′963 would maintain blood concentrations above the concentration required for 90% inhibition of RIP1 activity for an extended period of time compared with Nec-1 (Figure 3b; Supplementary Figure 1b). [1]

Cell Death Discov.2015 Jul 27;1:15009.

Necroptosis and signaling regulated by RIP1 kinase activity is emerging as a key driver of inflammation in a variety of disease settings. A significant amount has been learned about how RIP1 regulates necrotic cell death through the use of the RIP1 kinase inhibitor Necrostatin-1 (Nec-1). Nec-1 has been a transformational tool for exploring the function of RIP1 kinase activity; however, its utility is somewhat limited by moderate potency, off-target activity against indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO), and poor pharmacokinetic properties. These limitations of Nec-1 have driven an effort to identify next-generation tools to study RIP1 function, and have led to the identification of 7-Cl-O-Nec-1 (Nec-1s), which has improved pharmacokinetic properties and lacks IDO inhibitory activity. Here we describe the characterization of GSK′963, a chiral small-molecule inhibitor of RIP1 kinase that is chemically distinct from both Nec-1 and Nec-1s. GSK′963 is significantly more potent than Nec-1 in both biochemical and cellular assays, inhibiting RIP1-dependent cell death with an IC50 of between 1 and 4 nM in human and murine cells. GSK′963 is >10 000-fold selective for RIP1 over 339 other kinases, lacks measurable activity against IDO and has an inactive enantiomer, GSK′962, which can be used to confirm on-target effects. The increased in vitro potency of GSK′963 also translates in vivo, where GSK′963 provides much greater protection from hypothermia at matched doses to Nec-1, in a model of TNF-induced sterile shock. Together, we believe GSK′963 represents a next-generation tool for examining the function of RIP1 in vitro and in vivo, and should help to clarify our current understanding of the role of RIP1 in contributing to disease pathogenesis.[1]

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In the present study, we characterize GSK′963, a novel small-molecule inhibitor of RIP1 kinase that is structurally distinct from Nec-1 and Nec-1s. GSK′963 is over 200-fold more potent than Nec-1, displays exquisite selectivity for RIP1 kinase activity and has no effect on IDO activity or on TNF-mediated NFκB activation or apoptosis. GSK′963 is a chiral molecule allowing for use of its chemically identical inactive enantiomer as a negative control to confirm on-target activity of the inhibitor. Furthermore, GSK′963 provides complete protection in an in vivo model of TNF-induced sterile shock at a dose where Nec-1 shows no significant protection in the model. Taken together, we believe that GSK′963 represents an additional next-generation tool for exploring the role of RIP1 kinase-mediated biology.[1]

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Taken together, we have identified a novel, highly potent and selective inhibitor of RIP1 kinase activity. We believe that GSK′963 represents a next-generation tool inhibitor for investigating RIP1 biology in vitro, offering a significant benefit over the commercially available necrostatins.

C14H18N2O

230.31

230.141

C, 73.01; H, 7.88; N, 12.16; O, 6.95

2049872-86-6

GSK963;2049868-46-2

122703688

Typically exists as solid at room temperature

2.1

32.7

0

2

2

17

311

1

CC(C)(C)C(=O)N1[C@H](CC=N1)C2=CC=CC=C2

NJQVSLWJBLPTMD-GFCCVEGCSA-N

InChI=1S/C14H18N2O/c1-14(2,3)13(17)16-12(9-10-15-16)11-7-5-4-6-8-11/h4-8,10,12H,9H2,1-3H3/t12-/m1/s1

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (10.85 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (10.85 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。