LSD1/lysine specific demethylase 1

GSK690 (1-10μM) 与 JNJ-26481585-206 结合，在所有四种测试的 RMS 细胞系（RD、RH30、RMS13 和 TE381.T 细胞）中诱导细胞死亡。 GSK690/JNJ-26481585 共处理（对 RD 细胞使用 1 μM GSK690，对 RH30 细胞使用 10 μM GSK690）会改变促凋亡蛋白与抗凋亡蛋白的比例 [2]。 GSK690/JNJ-26481585 共处理对 RD 细胞使用 1 μM GSK690，对 RH30 细胞使用 10 μM GSK690，以引起 caspase 依赖性细胞死亡 [2]。通过添加 GSK690，JNJ-26481585 诱导的 G2/M 阻断得到进一步改善 [2]。

LSD1酶活性测定[1]
在康宁384孔低凸缘白色平底聚苯乙烯（编号3574）微孔板中，在10μL的反应体积中进行了检测，该反应体积由50 mM TrisHCl、50 mM NaCl、1 mM DTT、0.01%吐温-20和1%DMSO组成，在10点、3倍稀释系列中有或没有化合物，0.2μM组蛋白H3（1-21）K4（Me1）生物素肽底物和1 nM LSD1。在25°C下使反应进行30分钟，然后在LANCE检测缓冲液中加入0.3 mM反苯环丙胺停止反应，并通过加入1 nM铕-α-未修饰的H3K4抗体和25 nM ULight链霉抗生物素来定量去甲基化肽的水平，也在LANCE检测缓冲液中。在另外60分钟的潜伏期后，在PHERAstar FS平板阅读器上读取TR-FRET信号，激发波长为340 nm，发射波长为665 nm。

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SPR结合试验[1]
使用Biacore T200、S200和S51仪器通过SPR评估化合物与LSD1之间的直接结合。使用胺偶联将LSD1固定到CM5或CM7芯片上。在15°C下，在10 mM HEPES、pH 7.4、150 mM NaCl、1%DMSO、0.05%吐温中以30 mL/min的流速进行相互作用实验。化合物在缓冲液中稀释，并在制备的表面上以递增的浓度注射15-25秒。通过减去未经处理的参考通道的信号和空白注射的反应，对传感器图进行双重参考。使用T200评估软件3.0，通过稳态响应的剂量响应分析或整个传感图的回归分析（1:1相互作用模型，包括质量传输限制项）得出亲和力。

克隆形成试验[1]
在不含补充生长因子的甲基纤维素培养基中进行了人白血病细胞系的克隆试验。细胞以2.5×103接种，培养7天后计数菌落。

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CD86和细胞凋亡检测[1]
对于CD86检测，将白血病细胞系在含有化合物或DMSO（载体对照）的培养基中以1×105/mL的密度孵育48小时。将细胞沉淀，重新悬浮在含有0.25μL CD86-PerCP EF710（克隆IT2.2）的100 mL SM缓冲液（无酚红RPMI、5 mM EDTA和2%BSA）中，并在4°C下孵育10分钟。洗涤细胞，重新悬浮于SM缓冲液中，并通过流式细胞术进行分析。为了确定化合物对凋亡的影响，将白血病细胞系与10μM化合物或载体一起孵育4天。根据制造商的说明，使用BD Pharmingen PerCP-Cy5.5膜联蛋白V/7-AAD试剂盒评估细胞凋亡。所有FACS分析均使用LSR模型II或NovoCyte流式细胞仪或FACSArray生物分析仪进行。

[1]. Development of (4-Cyanophenyl)glycine Derivatives as Reversible Inhibitors of Lysine Specific Demethylase 1. J Med Chem. 2017 Oct 12;60(19):7984-7999.

[2]. Concomitant epigenetic targeting of LSD1 and HDAC synergistically induces mitochondrial apoptosis in rhabdomyosarcoma cells. Cell Death Dis. 2017 Jun 15;8(6):e2879.

The lysine-specific demethylase 1 (LSD1) is overexpressed in several cancers including rhabdomyosarcoma (RMS). However, little is yet known about whether or not LSD1 may serve as therapeutic target in RMS. We therefore investigated the potential of LSD1 inhibitors alone or in combination with other epigenetic modifiers such as histone deacetylase (HDAC) inhibitors. Here, we identify a synergistic interaction of LSD1 inhibitors (i.e., GSK690, Ex917) and HDAC inhibitors (i.e., JNJ-26481585, SAHA) to induce cell death in RMS cells. By comparison, LSD1 inhibitors as single agents exhibit little cytotoxicity against RMS cells. Mechanistically, GSK690 acts in concert with JNJ-26481585 to upregulate mRNA levels of the proapoptotic BH3-only proteins BMF, PUMA, BIM and NOXA. This increase in mRNA levels is accompanied by a corresponding upregulation of BMF, PUMA, BIM and NOXA protein levels. Importantly, individual knockdown of either BMF, BIM or NOXA significantly reduces GSK690/JNJ-26481585-mediated cell death. Similarly, genetic silencing of BAK significantly rescues cell death upon GSK690/JNJ-26481585 cotreatment. Also, overexpression of antiapoptotic BCL-2 or MCL-1 significantly protects RMS cells from GSK690/JNJ-26481585-induced cell death. Furthermore, GSK690 acts in concert with JNJ-26481585 to increase activation of caspase-9 and -3. Consistently, addition of the pan-caspase inhibitor N-benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone (zVAD.fmk) significantly reduces GSK690/JNJ-26481585-mediated cell death. In conclusion, concomitant LSD1 and HDAC inhibition synergistically induces cell death in RMS cells by shifting the ratio of pro- and antiapoptotic BCL-2 proteins in favor of apoptosis, thereby engaging the intrinsic apoptotic pathway. This indicates that combined treatment with LSD1 and HDAC inhibitors is a promising new therapeutic approach in RMS.[2]

C24H23N3O

369.458925485611

369.184

C, 78.02; H, 6.27; N, 11.37; O, 4.33

2101305-84-2

GSK 690 Hydrochloride;2436760-79-9

72793898

Typically exists as solid at room temperature

1.2±0.1 g/cm3

530.5±50.0 °C at 760 mmHg

274.6±30.1 °C

0.0±1.4 mmHg at 25°C

1.640

3.75

57.9Ų

1

4

5

28

527

1

O(C1=CN=C(C2C=CC(C)=CC=2)C(C2C=CC(C#N)=CC=2)=C1)C[C@H]1CNCC1

IQVDLEXWAPYWDT-LJQANCHMSA-N

InChI=1S/C24H23N3O/c1-17-2-6-21(7-3-17)24-23(20-8-4-18(13-25)5-9-20)12-22(15-27-24)28-16-19-10-11-26-14-19/h2-9,12,15,19,26H,10-11,14,16H2,1H3/t19-/m1/s1

(R)-4-[5-(Pyrrolidin-3-ylmethoxy)-2-p-tolyl-pyridin-3-yl]-benzonitrile

GSK690; GSK 690; CHEMBL3134377; GSK-690; (R)-4-(5-(Pyrrolidin-3-ylmethoxy)-2-(p-tolyl)pyridin-3-yl)benzonitrile; SCHEMBL18952126; GSK 690; GSK-354; GSK-690.

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。