FB23-2

FTO (IC50 = 2.6 μM)

FTO是一种信使核糖核酸N6-甲基腺苷（m6A）去甲基化酶，据报道可促进白血病的发生。采用基于结构的合理设计，我们开发了两种有前景的FTO抑制剂，即FB23和FB23-2，它们直接与FTO结合并选择性抑制FTO的m6A去甲基酶活性。FB23-2模拟FTO耗竭，在体外显著抑制人急性髓系白血病（AML）细胞系细胞和原代母细胞AML细胞的增殖并促进其分化/凋亡。[1]
FB23-2 直接连接到 FTO，以特定方式抑制其 m6A 去甲基酶活性。人急性髓系白血病 (AML) 细胞系细胞和原代母细胞 AML 细胞的增殖受到显着抑制，并在体外被鼓励分化/凋亡，模拟 FTO 耗尽。 [1]

在异种移植小鼠中，FB23-2显著减缓人类AML细胞系和原代细胞的发育。[1]
FB23-2抑制白血病进展并提高白血病小鼠的存活率。[1]
FB23-2在治疗患者来源的异种移植（PDX）AML小鼠模型中显示出疗效[1]
FB23-2在小鼠中是安全的，并且显示出良好的药代动力学特征。[1]

基于HPLC的RNA中m6A去甲基化抑制作用的测定[1]
对已报道的测定方法进行了一些修改，进行了体外ssRNA去甲基化（Huang et al.，2015）。将含有0.25μM FTOΔN31或3μM ALKBH5ΔN66、5μM 15聚体ssRNA（5′-AUGUCA（m6A）CAGCAGC-3′）、300μΜ2OG、280μΜ（NH4）2Fe（SO4）2、2 mM L-抗坏血酸和50 mM Tris-HCl（pH 7.5–8.0）中所需浓度的抑制剂的反应在25°C下孵育30分钟。通过在90°C下加热5分钟终止反应，然后用核酸酶P1和碱性磷酸酶消化混合物。使用GraphPad Prism 5.0™上的非线性回归、剂量-反应拟合，根据指定浓度抑制剂存在下m6A去甲基化的抑制百分比对IC50值进行定量。所有反应一式三份进行

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FTO/FB23配合物的结晶及结构测定[1]
结晶采用悬滴蒸汽扩散法在18°C下进行。将8mg/ml的FTOΔN31蛋白与5倍FB23孵育，并与含有100mM柠檬酸钠（pH 5.4）、11.5%（w/v）聚乙二醇3350和8%异丙醇的储液混合。使用额外的20%（v/v）甘油对晶体进行冷冻保护。衍射数据是在上海同步加速器研究设施（SSRF）的BL18U1和BL17U1光束线上收集的。所有X射线数据均使用HKL2000程序（Otwinowski和Minor，1997）进行处理，并在CCP4程序中转换为结构因子（Collaborative Computational Project，1994）。以FTO/MA配合物（PDB编码4QKN）的结构为搜索模型，在Phaser中通过分子置换求解该结构。用REFMAC5程序对结构复合体FTO/FB23的模型进行了计算精化。

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核磁共振（NMR）滴定法[1]
使用磷酸盐缓冲液（20mM磷酸钠（pH 7.4）、100mM NaCl、5%DMSO）在配备有25°C低温冷却探针的Bruker Avance III-600MHz光谱仪上进行NMR数据采集。实验样品分别含有200μM FB23和0μM、1μM、2μM和3μM的FTO蛋白

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细胞热位移测定法（CETSA）[1]
CETSA是根据先前描述的方案进行的（Martinez-Molina等人，2013）。收集NB4和MONOMAC6细胞，并在50mM Tris-HCl（pH 7.5）、150mM NaCl和2mM DTT中裂解。将50μM FB23或DMSO加入上清液中，并在25°C下孵育25分钟。在不同温度下变性5分钟后，离心样品，并通过蛋白质印迹分析上清液。所有实验一式三份进行。

当从AML小鼠分离的MA9和FLT3/NPM1原代细胞、五种人AML细胞（MA9.3ITD、MA9.3RAS、U937、ML2和MV4-11）和人原代AML细胞用DMSO或5μM FB23-2处理72小时进行点印迹分析时，NB4和MONOMAC6细胞用不同浓度的DMSO或FB23-2进行处理。[1]

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细胞增殖测定5000个细胞/孔NB4、FTO KO NB4和MONOMAC6 AML细胞接种并用DMSO或FTO抑制剂处理72小时。根据制造商的说明，用CellTiter 96®AQueous非放射性细胞增殖测定法测定细胞增殖。接种10000个细胞/孔的人AML细胞（MA9.3ITD、MA9.3RAS、U937、ML2和MV4-11）和来自AML患者的四个原代细胞，并如所示进行FTO抑制剂处理96小时。将从AML小鼠分离的10000个细胞/孔MA9和FLT3/NPM1原代细胞以及5000个细胞/孔shNS和shFTO NB4细胞接种并用FTO抑制剂处理24小时、48小时、72小时和96小时以进行增殖测定。[1]

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AML细胞NB4和MONOMAC6细胞中FB23和FB23-2的定量分别用10μM FB23或FB23-2处理24小时。用0.1%台盼蓝区分活细胞，计数，然后用PBS通过多次洗涤收获。用50%（v/v）水/甲醇将细胞稀释到100μl中，然后进行几个冲击冻融循环。收集上清液进行分析。应用与TSQ Quantiva质谱仪耦合的Ultimate 3000系统来测定化合物FB23和FB23-2的细胞浓度。在XSELECT™HSS T3柱（100 mm×3.0 mm，2.5μm；Waters，USA）上分离分析物。用于洗脱的流动相为（A）0.1%（v/v）甲酸/水和（B）0.1%（v/v）甲酸/乙腈。质谱仪在负MRM模式下操作。母公司到产品的转换为m/z 375.1→339.1, 375.1→FB23为298.1，m/z为390.3→318.0, 390.3→FB23-2分别为289.9。[1]

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m6A点印迹分析NB4和MONOMAC6细胞用不同浓度的DMSO或FB23-2处理72小时，而从AML小鼠分离的MA9和FLT3/NPM1原代细胞、5个人AML细胞（MA9.3ITD、MA9.3RAS、U937、ML2和MV4-11）和人原代AML细胞用DMSO或5μM FB23-2进行72小时的点印迹分析。根据制造商的说明，用miRNeasy Mini试剂盒分离总RNA，并用PolyATract mRNA分离系统IV进一步富集poly（A）+RNA。将RNA样品在RNA结合缓冲液中稀释，在65°C下变性5分钟。然后将一体积的20倍SSC缓冲液加入RNA样品中，然后用Bio-Dot仪器点在Amersham Hybond-N+膜上。通过紫外线照射将RNA样品交联到膜上。用0.02%亚甲基蓝（MB）作为负载对照对膜进行染色。紫外线交联和MB染色后，用PBST洗涤膜，在室温下用5%脱脂奶粉封闭1小时，并与m6A抗体（1:2000）在4°C下孵育过夜。最后，将膜与HRP缀合的山羊抗兔IgG孵育，并用Amersham ECL Prime Western印迹检测试剂显影。[1]

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LC-MS/MS定量AML细胞中的m6A和m6Am NB4和MONOMAC6细胞用二甲基亚砜或20μM FB23-2培养72小时。根据斑点印迹法分离信使核糖核酸，然后用Ribo-Minus转录组分离试剂盒去除受污染的rRNA。用5个单位的RppH用热塑性缓冲液将300 ng mRNA去帽，然后用核酸酶P1在42°C下消化产物1小时。随后，加入1单位碱性磷酸酶和NH4HCO3（100mM），并在37°C下再孵育1小时。Ultimate 3000系统与TSQ Quantiva质谱仪相结合，用于定量a、m6A和m6Am的细胞水平。将样品离心并加载到XSELECT™CSH™C18柱（100 mm×3.0 mm，2.5μm）上，并用梯度甲醇洗脱。A、m6A和m6Am的母体到产物的转变分别为268.1/136.1、282.1/150.1和296.2/150.1。

Animal model[1]
The NSGS mice were bred and subjected to the xeno-transplantation model. For the AML mouse model, 0.2 × 106 MONOMAC6 cells were directly transplanted into NSGS mice via tail vein. After 10 days, FB23-2 (2 mg/kg/day) and DMSO vehicle were intraperitoneally injected into the mice for a continuous 10 days. The mice were euthanized by CO2 inhalation if they exhibited classical AML symptoms including hunched posture, paralysis, and reduced body weight. Meanwhile, the PB, spleen, and liver samples were collected for further analysis.
PDX models were generated by injecting primary BM cells from AML patient Pt 2017_63 (2 X 106 per mouse) into the tail veins of 6- to 8-week-old sublethally irradiated (2.5 Gy) NSGS mice (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlTg(CMV-IL3, CSF2, KITLG)1Eav/MloySzJ), which were purchased from The Jackson Laboratory. When recipient mice had 3–5% donor-derived AML cells in PB, 6 mg/kg/day FB23-2 was delivered by i.p. for 17 days, vehicle DMSO was administrated as control. Mice were weighed daily during treatment and doses were recalculated to make sure the mice received a consistent dose of 6 mg/kg/day. One day after the 17-day full treatment, mice were randomly picked up, and then PB cells were collected and analyzed for the engraftment of leukemia cells by FACS using anti-human-CD45 and anti-mouse-CD45. When the mice became moribund, BM cells were collected and analyzed for the engraftment of leukemia cells by FACS using anti-human-CD45 and anti-mouse-CD45. In addition, the LSCs population was determined as the human CD34+CD38−population. For second transplantation, the patient AML cells, collected from the spleen of primary NSGS mice which were transplanted with BM cells from AML patients and received FB23-2 or DMSO treatment, were transplanted into NSGS mice irradiated at 2.5 Gy. 8 weeks post transplantation, PB cells were collected for FACS analysis using anti-human-CD45 and anti-mouse-CD45 and the mice were continued to monitor for survival.

[1]. Small-Molecule Targeting of Oncogenic FTO Demethylase in Acute Myeloid Leukemia. Cancer Cell. 2019 Apr 15;35(4):677-691.e10.

C18H15CL2N3O3

392.2360

391.05

C, 55.12; H, 3.85; Cl, 18.08; N, 10.71; O, 12.24

2243736-45-8

2243736-45-8

138454779

White to light yellow solid powder

4.9

87.4Ų

3

5

4

26

486

0

ILHNIWOZZKIBNW-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C18H15Cl2N3O3/c1-9-16(10(2)26-23-9)11-7-13(19)17(14(20)8-11)21-15-6-4-3-5-12(15)18(24)22-25/h3-8,21,25H,1-2H3,(H,22,24)

2-((2,6-dichloro-4-(3,5-dimethylisoxazol-4-yl)phenyl)amino)-N-hydroxybenzamide

FB 23-2; FB232; FB23-2; FB-23-2; FB 232; FB-232

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~25 mg/mL (~63.7 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.30 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.30 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 3 中的溶解度: 10 mg/mL (25.49 mM) in 50% PEG300 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。