Endogenous Metabolite

在用二十碳五烯酸钠（EPA；100 µM；24 小时）处理的细胞中，C/EBPβ 的磷酸化形式清晰可见，但在正常和 OA 或 LA 处理的 U937 细胞中几乎不明显 [1]。经过 1 和 3 小时的调理后，二十碳五烯酸钠（100 µM；1、3、24 小时）引起 H-Ras 和 N-Ras mRNA 水平显着升高。二十碳五烯酸钠对 K-Ras mRNA 水平没有影响 [1]。

确定了241项研究，其中28项符合上述纳入标准，因此被纳入随后的荟萃分析。使用随机效应模型，与安慰剂相比，补充omega3-LC-PUFA后，总体标准化平均抑郁评分降低（标准化平均差异=-0.291，95%CI=-0.463至-0.120，z=-3.327，p=0.001）。然而，存在显著的异质性和发表偏倚的证据。荟萃回归研究显示，基线抑郁水平较高和补充DHAEPA比例较低对治疗效果有显著影响。亚组分析显示，对以下方面有显著影响：（1）诊断类别（双相情感障碍和重度抑郁症，与轻度至中度抑郁症、慢性疲劳和非临床人群相比，补充omega3-LC-PUFA后有显著改善）；（2） 治疗性干预而非预防性干预；（3） 与单一疗法相反的辅助治疗；（4）补充类型。在使用纯DHA的3项研究中（标准化平均差0.001，95%置信区间-0.330至0.332，z=0.004，p=0.997），或在使用含有超过50%DHA的补充剂的4项研究中。相比之下，在13项使用含有超过50%EPA的补充剂的研究中（标准化平均差异=-0.446，95%CI=-0.753至-0.138，z=-2.843，p=0.005），以及在8项使用纯乙基EPA的研究中，抑郁症症状显著减轻（标准化平均差异=-0.396，95%CI=-0.650至-0.141，z=-3.051，p=0.002）。然而，进一步的元回归研究表明，疗效与研究方法质量、研究样本量和持续时间之间存在显著的负相关，从而限制了这些发现的置信度。结论：目前的荟萃分析提供了证据，表明EPA在治疗抑郁症方面可能比DHA更有效。然而，由于所纳入研究的局限性，需要更大、设计良好、持续时间足够长的随机对照试验来证实这些发现[4]。

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近视是全球视力受损和失明的主要原因。然而，目前还没有一种安全可行的近视控制和预防方法。在这里，我们研究了ω-3多不饱和脂肪酸（ω-3 PUFA）膳食补充剂对动物模型近视进展的治疗作用，以及对近距离工作引起的脉络膜血液灌注（ChBP）减少的治疗作用。近距离工作是年轻人近视的危险因素。我们证明，每天灌胃ω-3 PUFA（300mg二十二碳六烯酸[DHA]加60mg二十碳五烯酸[EPA]）可显著减轻豚鼠和小鼠的形觉剥夺性近视的发展，以及豚鼠的晶状体诱导性近视。球周注射DHA也抑制了形态剥夺豚鼠的近视进展。豚鼠近视的抑制伴随着“ChBP减少巩膜缺氧级联反应”的抑制。此外，DHA或EPA治疗拮抗了培养的人巩膜成纤维细胞中缺氧诱导的肌成纤维细胞转分化。在人类受试者中，口服ω-3 PUFA部分缓解了近工作引起的ChBP下降。因此，这些动物和人类研究的证据表明，ω-3 PUFA是控制近视的潜在和现成的候选者[2]。

C/EBPβ和H-Ras-CpG岛的DNA分离和定量DNA甲基化分析[1]
使用FlexiGene DNA试剂盒提取对照U937细胞或用100µM OA或100µM二十碳五烯酸/EPA生长24小时的U937细胞的基因组DNA。EMBOSS和MethPrimer在线软件程序用于识别C/EBPβ、N-Ras和H-Ras基因的潜在CpG岛。使用Methyl Profiler qPCR引物分析定量人C/EBPβ（MePH25981-3A）和H-Ras（MePH14574-1A）的DNA甲基化水平。qRT-PCR程序按照手册说明进行。如前所述，使用限制性酶切（DNA甲基化酶试剂盒MeA-03）对CpG岛的DNA甲基化状态进行分析，然后进行基于SYBR Green的实时PCR检测。使用ΔCt法计算每个DNA组分（甲基化和非甲基化）的相对量。

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亚硫酸氢盐修饰基因组DNA和测序[1]
使用FlexiGene DNA试剂盒从U937细胞、对照细胞或用100µM OA或100µM二十碳五烯酸/EPA培养24小时的细胞中获得基因组DNA。如前所述，进行亚硫酸氢盐反应以确定DNA甲基化状态。使用以下引物通过PCR扩增覆盖N-Ras-CpG岛（-29/+171）和H-Ras-CpG-岛B（640/882）的DNA片段。N-Ras：为5′-AAAGTTTTTGTGTGTGTGAGATTAGTAA-3′；修订版，5′-TTAAACAATTTAAACCACACC-3′。H-Ras：为5′-AGTTTTTTTGGTTGAAAGATGT-3′；rev，5′-ACACCCAAATTAACATAATC-3′。将PCR产物克隆到pCR2.1 TOPO中，并在Genechron Ylichron实验室使用T7引物对从两个独立PCR中随机挑选的六个克隆进行测序。

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染色质免疫沉淀[1]
使用EZ-ChIP试剂盒对U937细胞（约106个）进行ChIP检测，对照或用100µM OA或二十碳五烯酸/EPA培养24小时。细胞被交联，细胞裂解物被超声处理，直到染色质片段的大小变为200-1.000 bp。使用小鼠RNAPII 8WG16单克隆抗体MMS-126R或兔p53抗体#928进行免疫沉淀。小鼠或兔IgG用作阴性对照。免疫沉淀后，用Brilliant SYBR Green qPCR Master Mix对回收的染色质样本进行qRT-PCR。在RNAPII检测中，扩增的H-Ras序列位于i）外显子1（1/+135），ii）内含子1区域C（+136/+639），iii）CpG岛B（+640/+882），iv）内含子一区域D（+883/+1167）和v）外显体2（+1168/+1331）内。使用了以下引物。i） 外显子1：为5′-TGCCCCTGCCCGCAACCGAG-3′；修订版，5′-CGTTCACAGGGCGACTGCC-3′。ii）内含子1区C：为5′-GTGAACGGGTGAGGGCA-3′；修订版，5′-CGCGCGCGCGTATTGCTGC-3′。iii）CpG岛B：为5′-CCGTTTCTGGAGAGCGGTAA-3′；修订版，5′-GTCGGAGAAGGCTAAAGG-3′。iv）内含子1区D：5′-TCAGATGGCCCTGCCAGAG-3′；rev，5′-TTCCTACAGGGTCTCCTG-3′。v） 外显子2:for，5′CAGGAGACCTGTAGAGGA-3′；5′-GGATCAGCTGGATGGTCAGC-3′。在p53检测中，使用以下引物扩增含有CpG岛B p53元件的序列：for，5′-CGCTCAAAAATACTTGTCGG-3′；版次：5′-TTACCGTCCAGACAGG-3′。根据公式2-Δ[C（IP）-C（输入）]-2-Δ[C（对照IgG）-C（输出）]对数据进行定量分析。

Six-week-old male C57BL/6J mice were used. After one week of acclimatization with free access to standard mouse chow (commercial diet, 17.14% of energy from fat, 5.05 g/100 g) and water, the mice were randomly divided into nine groups each containing six mice and fed ALA series diets (1, 2.5, 5, or 7.5 wt%), 5% ALA and EPA series diets (0.25, 0.5, 1 wt%), EPA diet (2 wt%), or the control diet (Ctl diet: depleted in ω-3 PUFA) for seven weeks. The diet ingredients were shown in ESI Tables S1 and S2.† All animals were maintained in barrier cages and fed with the appropriate special diet restricted to 10 g per mouse per day.[3]

[1]. Eicosapentaenoic acid activates RAS/ERK/C/EBPβ pathway through H-Ras intron 1 CpG island demethylation in U937 leukemia cells. PLoS One. 2014 Jan 13;9(1):e85025.

[2]. Dietary ω-3 polyunsaturated fatty acids are protective for myopia. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021 Oct 26;118(43):e2104689118.

[3]. Endogenous omega-3 long-chain fatty acid biosynthesis from alpha-linolenic acid is affected by substrate levels, gene expression, and product inhibition. RSC Adv., 2017, 7, 40946-40951.

[4]. EPA but not DHA appears to be responsible for the efficacy of omega-3 long chain polyunsaturated fatty acid supplementation in depression: evidence from a meta-analysis of randomized controlled trials. J Am Coll Nutr, 2009. 28(5): p. 525-42.

Epigenetic alterations, including aberrant DNA methylation, contribute to tumor development and progression. Silencing of tumor suppressor genes may be ascribed to promoter DNA hypermethylation, a reversible phenomenon intensely investigated as potential therapeutic target. Previously, we demonstrated that eicosapentaenoic acid (EPA) exhibits a DNA demethylating action that promotes the re-expression of the tumor suppressor gene CCAAT/enhancer-binding protein δ (C/EBPδ). The C/EBPβ/C/EBPδ heterodimer formed appears essential for the monocyte differentiation commitment. The present study aims to evaluate the effect of EPA on RAS/extracellular signal regulated kinases (ERK1/2)/C/EBPβ pathway, known to be induced during the monocyte differentiation program. We found that EPA conditioning of U937 leukemia cells activated RAS/ERK/C/EBPβ pathway, increasing the C/EBPβ and ERK1/2 active phosphorylated forms. Transcriptional induction of the upstream activator H-Ras gene resulted in increased expression of H-Ras protein in the active pool of non raft membrane fraction. H-Ras gene analysis identified an hypermethylated CpG island in intron 1 that can affect the DNA-protein interaction modifying RNA polymerase II (RNAPII) activity. EPA treatment demethylated almost completely this CpG island, which was associated with an enrichment of active RNAPII. The increased binding of the H-Ras transcriptional regulator p53 to its consensus sequence within the intronic CpG island further confirmed the effect of EPA as demethylating agent. Our results provide the first evidence that an endogenous polyunsaturated fatty acid (PUFA) promotes a DNA demethylation process responsible for the activation of RAS/ERK/C/EBPβ pathway during the monocyte differentiation commitment. The new role of EPA as demethylating agent paves the way for studying PUFA action when aberrant DNA methylation is involved. [1]

C20H30O2

302.451

324.207

73167-03-0

Eicosapentaenoic Acid;10417-94-4

23679014

Typically exists as solid at room temperature

0.943 g/mL at 25ºC(lit.)

439.3ºC at 760 mmHg

-54--53ºC(lit.)

336ºC

n20/D 1.4977(lit.)

4.658

40.13

0

2

13

23

404

0

CC/C=C\C/C=C\C/C=C\C/C=C\C/C=C\CCCC(=O)[O-].[Na+]

RBZYGQJEMWGTOH-RSDXMDNYSA-M

InChI=1S/C20H30O2.Na/c1-2-3-4-5-6-7-8-9-10-11-12-13-14-15-16-17-18-19-20(21)22;/h3-4,6-7,9-10,12-13,15-16H,2,5,8,11,14,17-19H2,1H3,(H,21,22);/q;+1/p-1/b4-3-,7-6-,10-9-,13-12-,16-15-;

sodium;(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-icosa-5,8,11,14,17-pentaenoate

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。