Belnacasan (VX765)

Caspase-4 (Kd < 0.6 nM); Caspase-1 (Ki = 0.8 nM)

VRT-043198 是 VX-765 的口服吸收前药，对 ICE/caspase-1 和 caspase-4 具有有效抑制作用，Ki 分别为 0.8 nM 和小于 0.6 nM。此外，VRT-043198 还可阻断 PBMC 和全血中 IL-1β 的释放，IC50 值分别为 0.67 μM 和 1.9 μM。 [1]

在胶原诱导的关节炎小鼠模型中，VX-765 (200 mg/kg) 可抑制 LPS 诱导的 IL-1β 产生约 60%，导致炎症评分呈剂量依赖性且具有统计学显着性降低，并提供有效的关节保护。 [1]在不显着影响后放电长度的情况下，VX-765 通过阻止前脑星形胶质细胞中 IL-1β 的生长来阻断大鼠体内点燃癫痫发生。 [2]在急性癫痫发作的小鼠模型中，VX-765（50 mg/kg-200 mg/kg）通过延迟首次癫痫发作的时间并平均减少癫痫发作次数及其总持续时间来产生抗惊厥作用分别为 50% 和 64%。[3]第三次注射后，VX-765 通过特异性阻断 IL-1 生物合成，显着降低遗传性失神性癫痫 (GAERS) 成年大鼠的棘波放电 (SWD) 累积持续时间和数量，从而导致平均 55%。[4]

监测用对硝基苯胺或氨甲基香豆素 (AMC) 标记的合适底物的水解速率以确定酶是否被抑制：粒酶 B、Ac-IEPD-AMC； caspase-3、-7、-8 和 -9； caspase-4，Ac-WEHD-AMC； caspase-6，Ac-VEID-AMC；和 ICE/caspase-1，suc-YVAD-p-硝基苯胺。反应缓冲液含有 10 mM Tris、pH 7.5、0.1% (w/v) CHAPS、1 mM 二硫苏糖醇和 5% (v/v) 二甲亚砜，与酶和底物在 37 ° 下孵育 10 分钟C。为了提高 caspase-3、-6 和 -9 以及颗粒酶 B 的稳定性，将甘油以 8% (v/v) 的浓度添加到缓冲液中。使用荧光计测量底物水解速率。

通过测定VRT-043198对体外单核细胞释放细胞因子的影响，以及在几种动物模型中口服VX-765对体内细胞因子释放的影响，评估VX-765的治疗潜力。在受细菌产物刺激的健康人外周血单个核细胞和全血培养中，VRT-043198抑制白细胞介素(IL)-1 β和IL-18的释放，但对其他几种细胞因子的释放影响不大，包括IL-1 α、肿瘤坏死因子α、IL-6和IL-8。相比之下，VRT-043198在细胞凋亡模型中几乎没有或没有明显的活性，并且不影响活化的原代T细胞或T细胞系的增殖。小鼠口服VX-765可有效转化为VRT-043198，抑制脂多糖诱导的细胞因子分泌。此外，VX-765降低了类风湿性关节炎和皮肤炎症模型的疾病严重程度和炎症介质的表达。这些数据表明，VX-765是一种新的细胞因子抑制剂，可用于治疗炎症性疾病。[1]
在接触 LPS 之前，用 VX-765 将 PBMC 预处理 30 分钟。

Mice: Belnacasan is injected intravenously as single doses (10, 21, 43, and 84 mg/kg) in a vehicle (25% Cremophor EL in water). Through the retroorbital sinus, blood samples (roughly 0.25-0.3 mL) are taken before the dose is administered as well as 0.167, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, and 8 h later. These samples are processed for plasma. The concentration of Belnacasan and VRT-043198 is measured in plasma samples using a high-performance liquid chromatography/mass spectrometry methodology. Using WinNonlin Pro, version 4.0.1, noncompartmental analysis is performed.
Rats: Male Sprague-Dawley rats weighing 250–280 g are employed. Belnacasan (25, 50, or 200 mg/kg) is dissolved in 20% Cremophor and injected intraperitoneally (i.p.) into rats once daily for three straight days. Rats are given Belnacasan on the fourth day, 45 minutes and 10 minutes before intrahippocampal injections of kainic acid. Prior to the injection of kainic acid, respective controls receive a similar vehicle injection.

[1]. J Pharmacol Exp Ther . 2007 May;321(2):509-16.

[2]. Neurobiol Dis . 2008 Sep;31(3):327-33.

[3]. Neurotherapeutics . 2011 Apr;8(2):304-15.

[4]. Neurobiol Dis . 2011 Dec;44(3):259-69.

[5]. J Immunol . 2005 Aug 15;175(4):2630-4.

Belnacasan is a dipeptide.
VX-765 is the orally available prodrug of a potent and selective competitive inhibitor of ICE/caspase-1 (VRT-043198). VX-765 is currently under clinical development for the treatment of inflammatory and autoimmune conditions, as it blocks the hypersensitive response to an inflammatory stimulus.

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Drug Indication
Investigated for use/treatment in inflammatory disorders (unspecified) and psoriasis and psoriatic disorders.

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Mechanism of Action
VX-765 is a potent and selective inhibitor of ICE/caspase-1 sub-family caspases. In preclinical trials, VX-765 was efficiently converted to VRT-043198 when administered orally to mice and inhibited LPS-induced cytokine secretion. The result was a blocking of IL-1beta and IL-18 secretion, with out much effect on the release of several other cytokines, including IL-1{alpha}, tumor necrosis factor-{alpha}, IL-6 and IL-8. There was also no demonstrable activity in cellular models of apoptosis and it did not affect the proliferation of activated primary T-cells or T-cell lines.

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Pharmacodynamics
VX-765 is an orally-absorbed pro-drug of VRT-043198, a potent and selective inhibitor of ICE/caspase-1 sub-family caspases. It has been shown to reduce disease severity and the expression of inflammatory mediators in models of rheumatoid arthritis and skin inflammation, suggesting that it may be useful for treatment of inflammatory diseases.

C24H33CLN4O6

508.99

508.208

C, 56.63; H, 6.53; Cl, 6.97; N, 11.01; O, 18.86

273404-37-8

11398092

White to off-white solid powder

1.3±0.1 g/cm3

779.0±60.0 °C at 760 mmHg

424.9±32.9 °C

0.0±2.7 mmHg at 25°C

1.589

0.83

147.04

3

7

8

35

818

4

ClC1=C(C([H])=C([H])C(=C1[H])C(N([H])[C@]([H])(C(N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(N([H])[C@@]1([H])C([H])([H])C(=O)O[C@@]1([H])OC([H])([H])C([H])([H])[H])=O)=O)C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])=O)N([H])[H]

SJDDOCKBXFJEJB-MOKWFATOSA-N

InChI=1S/C24H33ClN4O6/c1-5-34-23-16(12-18(30)35-23)27-21(32)17-7-6-10-29(17)22(33)19(24(2,3)4)28-20(31)13-8-9-15(26)14(25)11-13/h8-9,11,16-17,19,23H,5-7,10,12,26H2,1-4H3,(H,27,32)(H,28,31)/t16-,17-,19+,23+/m0/s1

(2S)-1-[(2S)-2-[(4-amino-3-chlorobenzoyl)amino]-3,3-dimethylbutanoyl]-N-[(2R,3S)-2-ethoxy-5-oxooxolan-3-yl]pyrrolidine-2-carboxamide

Belnacasan; VX 765; VX765; Belnacasan (VX-765); Belnacasan (VX765); Belnacasan [USAN]; (S)-1-((S)-2-(4-amino-3-chlorobenzamido)-3,3-dimethylbutanoyl)-N-((2R,3S)-2-ethoxy-5-oxotetrahydrofuran-3-yl)pyrrolidine-2-carboxamide; VX-765

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~100 mg/mL (~196.5 mM)
Ethanol: ~100 mg/mL (~196.5 mM)

配方 1 中的溶解度: 3.33 mg/mL (6.54 mM) in 15% Cremophor EL + 85% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.91 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.91 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 4 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.91 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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配方 5 中的溶解度: 2% DMSO+30% PEG 300+ddH2O: 5mg/mL

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配方 6 中的溶解度: 5 mg/mL (9.82 mM) in 50% PEG300 + 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶.
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。