AZ1

USP25(IC50= 0.7 μM);USP28(IC50= 0.6 μM)

AZ1、AZ2和AZ4的体外图谱显示它们对USP28酶具有活性，并通过等热量热法（ITC）和微尺度热泳法（MST）与USP28结合。它们也被证明对USP2a具有选择性。第四种类似物（AZ3）在抑制USP28方面的效力明显较低，但保留了对USP2a的选择性[1]。

USP25/28 抑制剂 AZ1（AZ1；40 mg/kg；强饲法；每天；持续 7 天）可预防葡聚糖硫酸钠 (DSS) 引起的腹泻和体重减轻以及结肠缩短受损[1]。
结肠USP25/28 抑制剂 AZ1（20 mg/kg/天；灌胃；第 1、3 和 6 周每周 6 次）治疗显着减少肿瘤数量。肿瘤表现出 SOCS3 水平升高、pSTAT3 水平降低以及 Wnt 相关基因表达。 AZ1 灌胃对于治疗 Il10-/- 小鼠自发性结肠炎或 Usp25-/- 小鼠 DSS 诱导的结肠炎无效[1]。
USP25/28 抑制剂 AZ1（20 mg/kg/天；灌胃；每次13-20 周 3 天）可延长 AOM/Vil-Cre;Trp53fl/fl (VP) 小鼠的存活时间，并显着抑制结肠肿瘤发生。在 USP25 背景缺陷的情况下，AZ1 治疗对肿瘤发生几乎没有影响[1]。

在这些结合研究中，使用了两种独立的生物物理技术，第一种是等温滴定量热法（ITC）。这种无标记方法直接测量配体与靶蛋白结合时发生的相互作用的结合热，并可用于确认配体结合和计算相互作用的平衡离解常数（Kd）和化学计量。这些参数还可用于表征结合相互作用和证明酶的功能完整性。在我们的实验条件下，AZ1、AZ2和AZ4的Kd值分别为0.2、0.9和2.7μM（图1a–c；表1）。这些值与前面描述的生物化学活性数据一致。此外，AZ1、AZ2和AZ4的相应化学计量值分别为0.6、0.7和0.8（图1a–c），符合非纯粹和特定的结合模式，因此支持了我们从“比率测试”实验中的初步观察结果。为了进行比较，还测试了两种通过“比率测试”确定为可能通过替代机制发挥作用的化合物，并产生了嘈杂且难以解释的数据（数据未显示）。用于确认化合物与USP28结合的第二种方法使用了NanoTemper微尺度热电泳（MST）方法，该方法产生了可比较的数据。在这种情况下，AZ1和AZ2的Kd值分别为3.7和10.3μM（支持信息图S2a、b和表1）。根据ITC的数据，AZ3未能产生可确定的结果。使用蛋白质的固有荧光测定化合物的结合常数。我们认为，这导致了比荧光标记版本的方法灵敏度更低的检测系统。这可能在一定程度上解释了MST和ITC之间Kd估计值的明显差异。相反，AZ4使用标记的蛋白质产生Kd，这与ITC结果更为一致（3.6 vs 2.7μM；表1）。尽管Kd值高于在体外酶测定中获得的IC50值和来自我们的ITC实验的Kd值，但这些数据进一步证实了靶配体的参与。总之，这些来自两种独立方法的数据表明，AZ1、AZ2和AZ4以非纯粹和特异的方式与USP28相互作用并结合[1]。

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结合分析——等温滴定量热法[3]
USP28蛋白和测试化合物在40 mM HEPES（pH 7.5）和150 mM NaCl中透析，以尽量减少缓冲液不匹配或电离引起的热效应。ITC实验用Microcal iTC200仪器细胞中含有的20μM USP28蛋白进行，用仪器注射器中含有的200μM测试化合物滴定。使用Microcal ITC 200定量USP28与测试化合物的相互作用。在25°C下，在pH 7.5、150 mM NaCl和2%DMSO的40 mM HEPES中记录滴定数据。将200μM配体储备的等分试样以多个2μL的间隔添加到20μM USP28中。使用Microcal Origin软件使用非线性最小二乘回归对数据进行分析。

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USP选择性评估[3]
通过Ubiquigent（www.Ubiquigent.com）的DUBProfiler小组的测试，分析了整个DUB家族化合物的选择性。这涉及在一系列Ub-Rho110体外酶测定中加入浓度为10μM的测试化合物。为以下DUB家族成员生成并运行酶测定：14个USP（USP 1、2、4、5、7、11、15、19、20、25、28、36、45和CYLD），4个UCH（UCHL1、UCHL3、UCHL5和BAP1），3个OTU（OTUB2、OTUD6B）和1个JAMM（AMSH-LP）。生成的数据显示为每种酶对总酶活性的抑制百分比。以相同的方式对USP28和USP25进行剂量反应测试，测试100-0.03μM范围内的化合物。在30μM的固定筛选浓度下测试AZ1对半胱氨酸蛋白酶（包括胱天蛋白酶1/2/4/5/8和组织蛋白酶H/L/S）的选择性，数据以酶活性相对于DMSO对照的百分比报告。

用环己酰亚胺（100μg/mL）和蛋白酶体抑制剂MG132（20μM）预处理HCT116细胞，随后暴露于AZ1（60μM）或载体对照（DMSO）。在指定的时间点（从0到180分钟）裂解细胞，并通过蛋白质印迹探测c-Myc来分析样品。c-Myc的半衰期值通过基于这些印迹的密度计分析来确定。β-肌动蛋白作为负载对照。这些数据是来自至少三个独立实验的代表性数据[1]。

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细胞检测[3]
为了评估化合物的细胞活性，HCT116细胞用USP28抑制剂化合物处理3小时。孵育后，收获细胞，裂解并进行Western Blot分析。作为负荷对照，对样本进行c-Myc蛋白水平检测，并检测β-actin水平。为了确定c-Myc在细胞中的半衰期，在放线菌酮（100μg/mL）存在下，用USP28抑制剂处理HCT116细胞3小时，以阻断新生蛋白质合成。因此，c-Myc水平的任何变化都表明降解的变化，而不是蛋白质合成的变化。化合物处理后，在蛋白质印迹分析之前收获细胞并裂解

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细胞表征试剂[3]
USP28抑制剂（AZ1、AZ2、AZ3和AZ4）制备为100 mM DMSO储备，用于细胞培养实验。环己胺 终浓度为100μg/mL。MG132和碘化丙啶（PI）终浓度分别为20μM和10μg/mL。RNaseA购自Qiagen，终浓度为250μg/mL。CellTiter Glo（细胞活力测定）购自Promega。泛素乙烯基砜（Ub VS）最终浓度为32μg/mL。

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目标参与分析[3]
HCT116细胞用USP28抑制剂处理2小时。孵育后，将细胞在含有50 mM Tris（pH7.4）、150 mM NaCl、5 mM MgCl2、0.5 mM EDTA、0.5%NP40、10%甘油和2 mM DTT的TE裂解缓冲液中收获，并将澄清的细胞裂解物（40μg）与泛素乙烯基砜一起在冰上孵育1小时。通过加入LDS样品缓冲液终止反应，并加热至70°C。然后通过蛋白质印迹分析样品。

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增殖试验[3]
细胞通常以96孔板型接种（通常为4000-6000个细胞/孔），24小时后用浓度从0增加到100μM的化合物以1/2对数单位增量处理。72小时后，按照制造商的说明，通过CellTiter Glo评估细胞存活率。使用GraphPadPrism得出分析和EC50值。

Animal Model: Male Usp25+/+ and Usp25-/- mice aged 12 weeks[1]
Dosage: 40 mg/kg
Administration: Gavage; daily; for 7 days
Result: In comparison to control mice, the colons of Usp25-/-mice showed increased expression of proinflammatory cytokines and antibacterial peptides, and they were shielded from the weight loss and diarrhea caused by dextran sulfate sodium (DSS). They also showed impaired colon shortening.

[1]. ACS Chem Biol. 2017 Dec 15;12(12):3113-3125.

[2]. Nature Cancer volume 1, pages811–825(2020).

[3]. ACS Chem Biol. 2017 Dec 15;12(12):3113-3125. doi: 10.1021/acschembio.7b00334.

The ubiquitin proteasome system is widely postulated to be a new and important field of drug discovery for the future, with the ubiquitin specific proteases (USPs) representing one of the more attractive target classes within the area. Many USPs have been linked to critical axes for therapeutic intervention, and the finding that USP28 is required for c-Myc stability suggests that USP28 inhibition may represent a novel approach to targeting this so far undruggable oncogene. Here, we describe the discovery of the first reported inhibitors of USP28, which we demonstrate are able to bind to and inhibit USP28, and while displaying a dual activity against the closest homologue USP25, these inhibitors show a high degree of selectivity over other deubiquitinases (DUBs). The utility of these compounds as valuable probes to investigate and further explore cellular DUB biology is highlighted by the demonstration of target engagement against both USP25 and USP28 in cells. Furthermore, we demonstrate that these inhibitors are able to elicit modulation of both the total levels and the half-life of the c-Myc oncoprotein in cells and also induce apoptosis and loss of cell viability in a range of cancer cell lines. We however observed a narrow therapeutic index compared to a panel of tissue-matched normal cell lines. Thus, it is hoped that these probes and data presented herein will further advance our understanding of the biology and tractability of DUBs as potential future therapeutic targets.[1]

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Bacterial infection or abnormal colonization in the gastrointestinal system is associated with subsets of inflammatory bowel disease and colorectal cancer. Here we demonstrated essential roles of ubiquitin-specific protease 25 (USP25) in experimental colitis, bacterial infections and colon cancer. Knockout or pharmacologic inhibition of USP25 potentiated immune responses after induction of experimental colitis or bacterial infections that promoted clearance of infected bacteria and resolution of inflammation and attenuated Wnt and SOCS3–pSTAT3 signaling, which inhibited colonic tumorigenesis. USP25 levels were positively or negatively correlated with Fusobacterium nucleatum colonization and β-catenin levels or SOCS3 levels in human colorectal tumor biopsies, respectively, and predicted poor prognosis of patients with cancers in the gastrointestinal system. Our findings suggest USP25 as a promoter and druggable target for gastrointestinal infections and cancers.[2]

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The ubiquitin proteasome system is widely postulated to be a new and important field of drug discovery for the future, with the ubiquitin specific proteases (USPs) representing one of the more attractive target classes within the area. Many USPs have been linked to critical axes for therapeutic intervention, and the finding that USP28 is required for c-Myc stability suggests that USP28 inhibition may represent a novel approach to targeting this so far undruggable oncogene. Here, we describe the discovery of the first reported inhibitors of USP28, which we demonstrate are able to bind to and inhibit USP28, and while displaying a dual activity against the closest homologue USP25, these inhibitors show a high degree of selectivity over other deubiquitinases (DUBs). The utility of these compounds as valuable probes to investigate and further explore cellular DUB biology is highlighted by the demonstration of target engagement against both USP25 and USP28 in cells. Furthermore, we demonstrate that these inhibitors are able to elicit modulation of both the total levels and the half-life of the c-Myc oncoprotein in cells and also induce apoptosis and loss of cell viability in a range of cancer cell lines. We however observed a narrow therapeutic index compared to a panel of tissue-matched normal cell lines. Thus, it is hoped that these probes and data presented herein will further advance our understanding of the biology and tractability of DUBs as potential future therapeutic targets.[3]

C17H16BRF4NO2

422.2121

421.0301

C, 48.36; H, 3.82; Br, 18.92; F, 18.00; N, 3.32; O, 7.58

2165322-94-9

2165322-94-9

135397656

White to off-white solid powder

3.7

41.5Ų

2

7

7

25

399

0

BrC1C([H])=C([H])C(=C(C=1[H])C([H])([H])N([H])C([H])([H])C([H])([H])O[H])OC([H])([H])C1C([H])=C([H])C(=C(C(F)(F)F)C=1[H])F

ITHSFXDGKQYOED-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C17H16BrF4NO2/c18-13-2-4-16(12(8-13)9-23-5-6-24)25-10-11-1-3-15(19)14(7-11)17(20,21)22/h1-4,7-8,23-24H,5-6,9-10H2

2-(5-Bromo-2-(4-fluoro-3-(trifluoromethyl)benzyloxy)benzylamino)ethanol

AZ1; AZ-1; USP25/28 inhibitor AZ1; 2165322-94-9; USP25 and 28 inhibitor AZ-1; Ethanol, 2-[[[5-bromo-2-[[4-fluoro-3-(trifluoromethyl)phenyl]methoxy]phenyl]methyl]amino]-; CHEMBL4442615; 2-[[5-bromo-2-[[4-fluoro-3-(trifluoromethyl)phenyl]methoxy]phenyl]methylamino]ethanol; 2-((5-bromo-2-((4-fluoro-3-(trifluoromethyl)benzyl)oxy)benzyl)amino)ethanol; C17H16BrF4NO2; AZ 1; AZ1

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : 84~250 mg/mL ( 198.95~592.12 mM )
Ethanol : ~84 mg/mL

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.93 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.08 mg/mL (4.93 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.93 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。