Adelmidrol

PPARγ; COX-2; NF-κB

体外活性：Adelmidrol 是壬二酸的二乙醇酰胺衍生物，发挥有效的抗炎作用，部分依赖于 PPARγ。 Adelmidrol 减少 NF-κB 易位和 COX-2 表达。激酶测定：Ikb-α、核因子-κB (NF-κB)、环氧合酶-2 (COX-2)、磷酸细胞外信号调节激酶 (p-ERK)、Bcl-2、Bax、核纤层蛋白 a/c 的水平如前所述，在实验结束时收集的结肠组织的胞浆和核部分中计算 和 β-肌动蛋白，并进行较小的修改。将每只小鼠的结肠组织悬浮于含有0.2 mM苯甲基磺酰氟、0.15 mM胃酶抑素A、20 mM亮肽素、1 mM原钒酸钠的提取缓冲液A中，在最大设置下匀浆2分钟，并在12,000g×rpm下离心4分钟。在 4°C 下。上清液代表胞质部分。将含有富集细胞核的沉淀重悬于缓冲液 B 中，缓冲液 B 含有 1% Triton X-100、150 mM NaCl、10 mM Tris-HCl pH 7.4、1 mM EGTA、1 mM EDTA、0.2 mM 苯甲基磺酰氟、20 mM 亮肽素、0.2 mM 原钒酸钠。 4°C、12,000 rpm 离心 10 分钟后，将含有核蛋白的上清液保存在 -80°C 下以供进一步分析。过滤器用 1× PBS、5% (w/v) 脱脂奶粉在室温下封闭 40 分钟，并连续用抗 Ikb-α（PBS 中的 1/500，v/v，Santa Cruz Biotechnology）探测、抗 NF-κB（PBS 中的 1/500，v/v，Santa Cruz Biotechnology）、抗 COX-2（PBS 中的 1/500，v/v，开曼）、抗 p-ERK（1/500） PBS 中，v/v，Santa Cruz Biotechnology），抗 Bax（PBS 中的 SantaCruz Biotechnology 1/500，v/v），抗 Bcl-2（PBS 中的 1/500，v/v，Santa Cruz Biotechnology），和抗核纤层蛋白 a/c（PBS 中的 1/500，v/v，Santa Cruz Biotechnology），溶于 1× PBS、5%（w/v）脱脂奶粉、0.1% Tween-20 (PMT)，4°C过夜。将膜与过氧化物酶缀合的牛抗小鼠 IgG 二抗或过氧化物酶缀合的山羊抗兔 IgG（1:2000，杰克逊免疫研究公司，West Grove，PA）在室温下孵育 1 小时。为了确定印迹加载了等量的蛋白质裂解物，将它们与抗 β-肌动蛋白的抗体（PBS 中的 1/1000，v/，Santa Cruz Biotechnology v）类似地孵育。 Ikb-α (37 kDa)、NF-κB (65 kDa)、COX-2 (72 kDa)、p-ERK (46 kDa)、Bcl-2 (29 kDa)、Bax (23) 蛋白条带的相对表达kDa)、核纤层蛋白 a/c (65 kDa) 和 β-肌动蛋白 (42 kDa) 根据制造商的说明（SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）使用增强型化学发光检测系统进行检测。使用 Bio-Rad ChemiDoc XRS + 软件（Hercules，CA）通过密度测定法计算蛋白质条带的表达，并标准化为 β-肌动蛋白水平。将印迹信号图像（8 位/600 dpi 分辨率）导入分析程序（Image Quant TL，v2003）。使用市售分子量标记（10-250 kDa）来确定分子量位置。髓过氧化物酶测定：根据先前公布的方法，通过使用四甲基联苯胺作为底物的分光光度测定测定组织髓过氧化物酶（MPO）活性来检查结肠中的中性粒细胞浸润。注射DNBS后，收集结肠组织并称重。将每块组织在含有溶解在 10 mM 磷酸钾缓冲液（pH 7）中的 0.5% 十六烷基三甲基溴化铵的混合物中匀浆，并在 4°C 下以 20,000g 离心 30 分钟。然后使等分的上清液与1.6 mM 四甲基联苯胺和0.1 mM H2O2 的溶液反应。通过分光光度法在 650 nm 处测量吸光度的变化程度。 MPO 活性描述为在 37°C 下每分钟降解 1 mmol 过氧化物的酶量，以 U/g 湿组织表示。

在结肠内给予二硝基苯磺酸诱导的结肠炎小鼠实验模型中，阿地米醇治疗可减少腹泻、体重减轻和髓过氧化物酶活性。此外，adelmidrol 治疗可减少核因子-κB 易位、环氧合酶-2 和磷酸细胞外信号调节激酶的表达。促炎细胞因子释放；以及结肠中硝基酪氨酸和聚（ADP）核糖的发生率。它还降低了 ICAM-1 和 P-选择素的上调。 Adelmidrol 治疗导致 Bax 减少和 Bcl-2 表达增强。总之，adelmidrol 发挥重要的抗炎作用，部分依赖于 PPARγ，表明该分子可能代表炎症性肠病治疗的新药理学方法。雄性成年 CD1 小鼠（25-30 g，Envigo，意大利）和雄性小鼠（2027 g，Envigo，意大利），其中 PPARα 基因有针对性的破坏 [PPARα 敲除 [KO]）和同窝野生型对照 [PPARα 野生型]类型（WT）]被放置在受控环境中并维持12小时的光/暗循环，并且可随意获取食物和水。这项研究得到了墨西拿大学动物保护审查委员会的批准。 （DM116192 和 EC L 358/1 12/18/1986 的 OJ）。

Ikb-α、核因子-κB (NF-κB)、环氧合酶-2 (COX-2)、磷酸细胞外信号调节激酶 (p-ERK)、Bcl-2、Bax、核纤层蛋白 a/c 和 β 的水平如前所述，在实验结束时收集的结肠组织的胞质和核级分中计算β-肌动蛋白，并进行较小的修改。将每只小鼠的结肠组织悬浮于含有0.2 mM苯甲基磺酰氟、0.15 mM胃酶抑素A、20 mM亮肽素、1 mM原钒酸钠的提取缓冲液A中，在最大设置下匀浆2分钟，并在12,000g×rpm下离心4分钟。在 4°C 下。上清液代表胞质部分。将含有富集细胞核的沉淀重悬于缓冲液 B 中，缓冲液 B 含有 1% Triton X-100、150 mM NaCl、10 mM Tris-HCl pH 7.4、1 mM EGTA、1 mM EDTA、0.2 mM 苯甲基磺酰氟、20 mM 亮肽素、0.2 mM 原钒酸钠。 4°C、12,000 rpm 离心 10 分钟后，将含有核蛋白的上清液保存在 -80°C 下以供进一步分析。过滤器用 1× PBS、5% (w/v) 脱脂奶粉在室温下封闭 40 分钟，并连续用抗 Ikb-α（PBS 中的 1/500，v/v，Santa Cruz Biotechnology）探测、抗 NF-κB（PBS 中的 1/500，v/v，Santa Cruz Biotechnology）、抗 COX-2（PBS 中的 1/500，v/v，开曼）、抗 p-ERK（1/500） PBS 中，v/v，Santa Cruz Biotechnology），抗 Bax（PBS 中的 SantaCruz Biotechnology 1/500，v/v），抗 Bcl-2（PBS 中的 1/500，v/v，Santa Cruz Biotechnology），和抗核纤层蛋白 a/c（PBS 中的 1/500，v/v，Santa Cruz Biotechnology），溶于 1× PBS、5%（w/v）脱脂奶粉、0.1% Tween-20 (PMT)，4°C过夜。将膜与过氧化物酶缀合的牛抗小鼠 IgG 二抗或过氧化物酶缀合的山羊抗兔 IgG（1:2000，杰克逊免疫研究公司，West Grove，PA）在室温下孵育 1 小时。为了确定印迹加载了等量的蛋白质裂解物，将它们与抗 β-肌动蛋白的抗体（PBS 中的 1/1000，v/，Santa Cruz Biotechnology v）类似地孵育。 Ikb-α (37 kDa)、NF-κB (65 kDa)、COX-2 (72 kDa)、p-ERK (46 kDa)、Bcl-2 (29 kDa)、Bax (23) 蛋白条带的相对表达kDa)、核纤层蛋白 a/c (65 kDa) 和 β-肌动蛋白 (42 kDa) 根据制造商的说明（SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）使用增强型化学发光检测系统进行检测。使用 Bio-Rad ChemiDoc XRS + 软件（Hercules，CA）通过密度测定法计算蛋白质条带的表达，并标准化为 β-肌动蛋白水平。将印迹信号图像（8 位/600 dpi 分辨率）导入分析程序（Image Quant TL，v2003）。使用市售分子量标记（10-250 kDa）来确定分子量位置。

根据先前描述的技术，使用分光光度测定以四甲基联苯胺作为底物来测量组织髓过氧化物酶（MPO）活性，以检查结肠中的中性粒细胞浸润。注射 DNBS 后收集结肠组织并称重。将每块组织在含有溶解在 10 mM 磷酸钾缓冲液（pH 7）中的 0.5% 十六烷基三甲基溴化铵的溶液中匀浆，并在 4°C 下以 20,000g 离心 30 分钟。然后使上清液与含有1.6mM四甲基联苯胺和0.1mM H2O2的溶液反应。在 650 nm 处，通过分光光度法测量吸光度变化的幅度。 MPO活性定义为在37℃下每分钟能够分解1mmol过氧化物的酶量，以U/g湿组织表示。

Mice: Male CD1 adult mice weighing 25 to 30 g and male mice weighing 20 to 27 g are kept in a controlled environment on a 12-hour light/dark cycle with unlimited access to food and water. The following groups of mice are randomly assigned (10 per group): (1)Sham+vehicle group: Saline (the vehicle solution) is administered orally for 4 days. (2) O.s. administration of Sham+Adelmidrol (10 mg/kg) for 4 days. (3) DNBS+vehicle: Mice are given an injection of DNBS as described, and then a vehicle (saline) is administered intravenously every day for four days, beginning 60 minutes after the DNBS injection. (4) DNBS+Adelmidrol (10 mg/kg): Mice are given DNBS injections as directed, and Adelmidrol (10 mg/kg) is administered orally daily beginning 60 minutes after DNBS injections[1].

[1]. Adelmidrol, a Palmitoylethanolamide Analogue, as a New Pharmacological Treatment for the Management of Inflammatory Bowel Disease. Mol Pharmacol. 2016 Nov;90(5):549-561.

Adelmidrol is under investigation in clinical trial NCT01420510 (Saginil in vs. Placebo for Gynecologic Oncology Patients Affected by Vaginitis).

C13H26N2O4

274.36

274.189

C, 56.91; H, 9.55; N, 10.21; O, 23.33

1675-66-7

176874

White to off-white solid powder

1.097g/cm3

596.4ºC at 760mmHg

132-134 ºC

314.5ºC

1.04E-16mmHg at 25°C

1.492

0.715

98.66

4

4

12

19

223

0

O=C(C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(N([H])C([H])([H])C([H])([H])O[H])=O)N([H])C([H])([H])C([H])([H])O[H]

PAHZPHDAJQIETD-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C13H26N2O4/c16-10-8-14-12(18)6-4-2-1-3-5-7-13(19)15-9-11-17/h16-17H,1-11H2,(H,14,18)(H,15,19)

N,N'-bis(2-hydroxyethyl)nonanediamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ≥ 30 mg/mL

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (7.58 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (7.58 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (7.58 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。