KDM1/LSD1

在所有四种研究的 RMS 细胞系（RD、RH30、RMS13 和 TE381.T 细胞）中，GSK690 (1-10 μM) 和 JNJ-26481585 协同作用导致细胞死亡[2]。 GSK690/JNJ-26481585 共处理改变了促凋亡和抗凋亡蛋白平衡，其中 RD 细胞使用 1 μM GSK690，RH30 细胞使用 10 μM GSK690[2]。 GSK690/JNJ-26481585 共处理会导致浓度为 10 μM 的 RH30 细胞和浓度为 1 μM 的 RD 细胞发生 caspase 依赖性细胞死亡 [2]。添加 GSK690 可以进一步增强 JNJ-26481585 诱导的 G2/M 期阻滞 [2]。

LSD1酶活性测定[1]
在康宁384孔低凸缘白色平底聚苯乙烯（编号3574）微孔板中，在10μL的反应体积中进行了检测，该反应体积由50 mM TrisHCl、50 mM NaCl、1 mM DTT、0.01%吐温-20和1%DMSO组成，在10点、3倍稀释系列中有或没有化合物，0.2μM组蛋白H3（1-21）K4（Me1）生物素肽底物和1 nM LSD1。在25°C下使反应进行30分钟，然后在LANCE检测缓冲液中加入0.3 mM反苯环丙胺停止反应，并通过加入1 nM铕-α-未修饰的H3K4抗体和25 nM ULight链霉抗生物素来定量去甲基化肽的水平，也在LANCE检测缓冲液中。在另外60分钟的潜伏期后，在PHERAstar FS平板阅读器上读取TR-FRET信号，激发波长为340 nm，发射波长为665 nm。

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SPR结合试验[1] 使用Biacore T200、S200和S51仪器通过SPR评估化合物与LSD1之间的直接结合。使用胺偶联将LSD1固定到CM5或CM7芯片上。在15°C下，在10 mM HEPES、pH 7.4、150 mM NaCl、1%DMSO、0.05%吐温中以30 mL/min的流速进行相互作用实验。化合物在缓冲液中稀释，并在制备的表面上以递增的浓度注射15-25秒。通过减去未经处理的参考通道的信号和空白注射的反应，对传感器图进行双重参考。使用T200评估软件3.0，通过稳态响应的剂量响应分析或整个传感图的回归分析（1:1相互作用模型，包括质量传输限制项）得出亲和力。

转导[2]
对于BCL-2的过表达，如前所述，使用磷酸钙转染法用20μg含有小鼠BCL-2（mBCL-2）或EV的小鼠干细胞病毒（pMSCV）载体转染Phoenix包装细胞。39通过慢病毒转导产生稳定的细胞系，并用10μg/ml Blasticidin进行筛选。对于MCL-1过表达，使用Lipofectamine 2000，用20μg的pCMV-Tag3B质粒转染细胞，该质粒由Genentech股份有限公司提供，含有EV、野生型MCL-1（WT）或磷酸化突变MCL-1。

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RNA干扰[2]
对于siRNA的瞬时敲除，使用Lipofectamine RNAiMAX试剂和OptiMEM用10 nM（BMF、BIM、NOXA）和20 nM（BAK）SilencerSelect siRNA反向转染细胞。使用了以下siRNA构建体：对照siRNA（4390842）和靶向siRNA（BMF的s40385和s40387，BIM的s195012和s223065，NOXA的s10708和s10709，BAK的s1880和s1881）。

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蛋白质印迹分析[2]
如前所述，使用以下抗体进行蛋白质印迹分析：小鼠抗NOXA、大鼠抗BMF、兔抗MCL-1、小鼠抗BCL-2、兔抗BAK、兔抗半胱氨酸蛋白酶-3、兔抗丝氨酸蛋白酶-9、兔抗BIM、小鼠抗PARP、兔抗PUMA、兔抗BCL-xL、小鼠抗GAPDH、兔抗H3K4me2、兔防乙酰化组蛋白H3和小鼠抗组蛋白H3或小鼠抗β-Actin。使用与辣根过氧化物酶结合的山羊抗小鼠、山羊抗兔和山羊抗大鼠IgG以及增强化学发光或红外染料标记的二抗和红外成像进行检测。为了检测组蛋白修饰，使用补充有皮尔斯核酸酶的RIPA缓冲液裂解细胞。显示了至少两个独立实验的代表性印迹。

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定量实时PCR[2]
根据制造商的说明，使用peqGOLD总RNA试剂盒分离总RNA。对于cDNA合成，根据制造商的方案，使用随机引物，使用RevertAid H减第一链cDNA合成试剂盒，使用1μg总RNA合成相应的cDNA。为了定量基因表达水平，使用7900GR快速实时PCR系统进行了基于SYBR绿色的定量实时PCR。以28S rRNA表达作为参考对数据进行标准化。熔解曲线分析可作为扩增产物特异性的对照。通过使用ΔΔct方法计算靶转录物与参考转录物的相对表达水平。每个基因至少进行了三次独立的重复实验。

[1]. Development of (4-Cyanophenyl)glycine Derivatives as Reversible Inhibitors of Lysine Specific Demethylase 1. J Med Chem. 2017 Oct 12;60(19):7984-7999.

[2]. Concomitant epigenetic targeting of LSD1 and HDAC synergistically induces mitochondrial apoptosis in rhabdomyosarcoma cells. Cell Death Dis. 2017 Jun 15;8(6):e2879.

Inhibition of lysine specific demethylase 1 (LSD1) has been shown to induce the differentiation of leukemia stem cells in acute myeloid leukemia (AML). Irreversible inhibitors developed from the nonspecific inhibitor tranylcypromine have entered clinical trials; however, the development of effective reversible inhibitors has proved more challenging. Herein, we describe our efforts to identify reversible inhibitors of LSD1 from a high throughput screen and subsequent in silico modeling approaches. From a single hit (12) validated by biochemical and biophysical assays, we describe our efforts to develop acyclic scaffold-hops from GSK-690 (1). A further scaffold modification to a (4-cyanophenyl)glycinamide (e.g., 29a) led to the development of compound 32, with a Kd value of 32 nM and an EC50 value of 0.67 μM in a surrogate cellular biomarker assay. Moreover, this derivative does not display the same level of hERG liability as observed with 1 and represents a promising lead for further development.[1]

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The lysine-specific demethylase 1 (LSD1) is overexpressed in several cancers including rhabdomyosarcoma (RMS). However, little is yet known about whether or not LSD1 may serve as therapeutic target in RMS. We therefore investigated the potential of LSD1 inhibitors alone or in combination with other epigenetic modifiers such as histone deacetylase (HDAC) inhibitors. Here, we identify a synergistic interaction of LSD1 inhibitors (i.e., GSK690, Ex917) and HDAC inhibitors (i.e., JNJ-26481585, SAHA) to induce cell death in RMS cells. By comparison, LSD1 inhibitors as single agents exhibit little cytotoxicity against RMS cells. Mechanistically, GSK690 acts in concert with JNJ-26481585 to upregulate mRNA levels of the proapoptotic BH3-only proteins BMF, PUMA, BIM and NOXA. This increase in mRNA levels is accompanied by a corresponding upregulation of BMF, PUMA, BIM and NOXA protein levels. Importantly, individual knockdown of either BMF, BIM or NOXA significantly reduces GSK690/JNJ-26481585-mediated cell death. Similarly, genetic silencing of BAK significantly rescues cell death upon GSK690/JNJ-26481585 cotreatment. Also, overexpression of antiapoptotic BCL-2 or MCL-1 significantly protects RMS cells from GSK690/JNJ-26481585-induced cell death. Furthermore, GSK690 acts in concert with JNJ-26481585 to increase activation of caspase-9 and -3. Consistently, addition of the pan-caspase inhibitor N-benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone (zVAD.fmk) significantly reduces GSK690/JNJ-26481585-mediated cell death. In conclusion, concomitant LSD1 and HDAC inhibition synergistically induces cell death in RMS cells by shifting the ratio of pro- and antiapoptotic BCL-2 proteins in favor of apoptosis, thereby engaging the intrinsic apoptotic pathway. This indicates that combined treatment with LSD1 and HDAC inhibitors is a promising new therapeutic approach in RMS.[2]

C24H24CLN3O

405.919864654541

405.16

2436760-79-9

GSK 690;2101305-84-2

135397147

Typically exists as Light yellow to yellow solids at room temperature

57.9Ų

2

4

5

29

527

1

Cl.O(C1C=NC(C2C=CC(C)=CC=2)=C(C2C=CC(C#N)=CC=2)C=1)C[C@H]1CNCC1

DBTSJYXXWZFXNJ-FSRHSHDFSA-N

InChI=1S/C24H23N3O.ClH/c1-17-2-6-21(7-3-17)24-23(20-8-4-18(13-25)5-9-20)12-22(15-27-24)28-16-19-10-11-26-14-19;/h2-9,12,15,19,26H,10-11,14,16H2,1H3;1H/t19-;/m1./s1

4-[2-(4-methylphenyl)-5-[[(3R)-pyrrolidin-3-yl]methoxy]pyridin-3-yl]benzonitrile;hydrochloride

GSK 690 (Hydrochloride); 2436760-79-9; EX-A8792;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : 125 mg/mL (307.94 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.12 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.12 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.12 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。