TET1 33 μM (IC50) TET2 73 μM (IC50)

用 10 μM Bobcat339 盐酸盐抑制 HT-22 细胞中的 TET 酶功能 24 小时，可显着降低 5hmC 水平 [1]。

Bobcat339是一种控制AgRP神经元中TET3的合成小分子，能够在小鼠模型中减轻神经性厌食症和相关的焦虑/抑郁行为。我们发现Bobcat339起到破坏AgRP神经元中TET3蛋白稳定的作用，并且这种调节在人类和小鼠细胞中是保守的。我们建议Bobcat339应该作为神经性厌食症的治疗方法，可能是癌症诱导的厌食症和相关的情绪障碍。[2]

化学发光ELISA。[1]
程序改编自手册。制备TBST缓冲液（1X TBS，pH 8.0，含0.05%吐温-20）。用稀释水将4.0X TET测定缓冲液（TAB）稀释至1.5X TAB和1.0X TAB。用1.0X TAB解冻并稀释试剂盒中的TET酶（TET1为5.0纳克/μl，TET2为10纳克/μl）。用封闭缓冲液将一抗稀释100倍。用封闭缓冲液稀释1000倍的第二抗体。用1.0X TAB将DMSO抑制剂溶液稀释至所需浓度（确保溶液为5%DMSO）。向提供的96孔板中，向每个孔中加入200μl TBST缓冲液，并在室温下孵育15分钟。取出TBST缓冲溶液，向每个孔中加入20μl 1.5X TAB、10μl抑制剂溶液和20μl稀释的TET。对于对照，加入10μl 5%二甲基亚砜溶液和20μl 1.0X TAB。在室温下培养2小时。取出反应溶液，用TBST缓冲液（200、200和100μl）洗涤3次。加入100μl封闭缓冲液53μl稀释的一抗，在室温下振荡1小时。取出稀释的一抗体，用TBST缓冲液（200、200和100μl）洗涤3X。向每个孔中加入100μl封闭缓冲液，在室温下振荡10分钟。取出封闭缓冲液。加入100μl稀释的二抗。在室温下振荡30分钟。取出稀释的第二抗体，并用TBST缓冲液（200、200和100μl）洗涤3X。向每个孔中加入100μl封闭缓冲液，在室温下振荡10分钟。取出封闭缓冲液。将辣根过氧化物酶（HRP）底物A和HRP底物B以1:1的比例混合。向每个孔中加入100μl HRP溶液。立即读取化学发光[1]。

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TET酶计算模型。[1]
在分子操作环境（MOE）软件中使用已求解的与DNA结合的人TET2的晶体结构（PDB:4NM6）进行所有计算分析。1然后通过将其相关一级序列与TET2的一级序列对齐来产生人TET1的同源性模型（图S1），然后使用MOE软件包中的Amber 10 EHT力场在N-草甘氨-铁-甲基化双链DNA复合物周围诱导拟合取代线性氨基酸序列。TET2用N-草酰甘氨酸（一种KG依赖性双加氧酶的泛抑制剂）结晶并与dsDNA结合。对于TET1和TET2模型，N-草酰甘氨酸中的氮与KG共因子位点结合并螯合催化Fe中心，然后转化为sp3杂交的碳以产生KG。然后，从模型中去除dsDNA，并将活性位点中结合的5mC用作所有基于胞嘧啶的抑制剂的起始姿势。

细胞培养[1]
HT22细胞由索尔克研究所的David Schubert提供。细胞在补充有10%FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基中在37°C和5%CO2下培养。将HT22细胞保持在50-70%的融合度，并且每周传代两次。简单地说，去除培养基并用0.05%胰蛋白酶代替。将细胞与胰蛋白酶孵育5分钟，并将1.5倍体积的培养基加入到细胞胰蛋白酶悬浮液中。最后，将细胞以1:10的比例加入35mm培养皿中的新鲜培养基中用于实验。用Bobcat339和Bobcat212的制备溶液处理培养的HT22细胞。将22μl DMSO中的化合物加入到含有2.2 ml细胞培养基的培养皿中，得到10μM的抑制剂终浓度和1%的DMSO总浓度。Bobcat339浓度越高，溶解性越差。将细胞在37°C和5%CO2下孵育24小时。

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DNA提取[1]
程序改编自手册。从盘子里取出培养基。向每个培养皿中加入180μl缓冲液ATL并刮去。将液体转移到1.5毫升微量离心管中。对于每个样品，加入20μl蛋白酶K并立即通过脉冲涡流混合。在56°C下培养过夜。培养后，从培养箱中取出并立即涡旋15秒。向每个试管中加入4μl RNase A，并立即涡旋。在RT的工作台上孵育2分钟。向每个样品中加入200μl缓冲液AL，并通过涡流充分混合。加入200μl乙醇（100%）。立即通过涡流混合。用移液管将每个样品混合物移到放置在2ml收集管中的DNeasy旋转柱中。以6000 x g（6000 rcf）离心1分钟。丢弃流通管和收集管。将每个旋转柱放入新的2 ml收集管中，加入600μl缓冲液AW1，并在6000 x g下离心1分钟。丢弃流通管和收集管。将旋转柱放入新的2 ml收集管中，加入600μl缓冲液AW2，在18213 x g（18213 rcf）下离心3分钟。丢弃流通管和收集管，将旋转柱放入新的2 ml收集管中，并在18213 x g（18213 rcf）下再离心3分钟。将旋转柱放入标有1.5 mL带帽离心管的最终完整描述中。向每个旋转柱中加入22μl不含DNase/RNase的水作为洗脱缓冲液，并在室温下在台式机上孵育15分钟。以6000 x g（6000 rcf=6000 x g）离心1分钟，并丢弃旋转柱。使用NanoDrop分光光度计测定DNA浓度，并将样品储存在-20°C下。

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MethylFlash全局DNA羟甲基化（5-hmC）ELISA简易试剂盒（比色法）[1]
程序改编自手册（Epigentek:P-1032-48）。通过向117 ml蒸馏水中加入13 ml 10X洗涤缓冲液并调节pH 10 7.2-7.5，制备稀释洗涤缓冲液（1X洗涤缓冲液）。向每个孔中加入100μl结合溶液，然后加入100 ng提取的样品DNA或已知标准品，然后在37°C下孵育1小时。在培养的最后10分钟内，通过每毫升稀释WB（4-5毫升）加入1μl hmAb、信号指示剂和增强剂溶液，制备5-hmC检测复合物溶液。孵育1小时后，从每个孔中取出结合溶液，并用150μl稀释的WB洗涤每个孔三次。洗涤后，向每个孔中加入50μl 5-hmC检测复合物溶液，轻轻摇动平板混合，然后盖上盖子，在室温下孵育50分钟。孵育后，从每个孔中取出抗体溶液，每次用150μl洗涤每个孔5次。洗涤后，7向每个孔中逐柱添加100μl显影剂溶液，以便同时进行重复显影。孵育3-5分钟或直到1%PC孔中的溶液变成深蓝色。通过向每个孔中逐柱添加100μl停止溶液来停止反应。培养2分钟，然后读取450 nm处的吸光度.

Bobcat339, a synthetic small molecule that controls TET3 in AgRP neurons, is able to mitigate anorexia nervosa and associated anxiety/depressive behaviors in a murine model. We show that Bobcat339 acts to destabilize TET3 protein in AgRP neurons and that this regulation is conserved in human and mouse cells. We propose that Bobcat339 should be pursued as a therapeutic for anorexia nervosa and perhaps cancer-induced anorexia and associated mood disorders.[2]

[1]. Chua GNL, et al. Cytosine-Based TET Enzyme Inhibitors. ACS Med Chem Lett. 2019 Jan 31;10(2):180-185.

C16H13CL2N3O

334.20

333.0435674

C, 57.50; H, 3.92; Cl, 21.21; N, 12.57; O, 4.79

2436747-44-1

Bobcat339;2280037-51-4

138319672

Solid powder

58.7Ų

ClC1C(N([H])[H])=NC(N(C=1[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C(C2C([H])=C([H])C([H])=C([H])C=2[H])=C1[H])=O.Cl[H]

ZOMPKMMOPYMRIB-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C16H12ClN3O.ClH/c17-14-10-20(16(21)19-15(14)18)13-8-4-7-12(9-13)11-5-2-1-3-6-11;/h1-10H,(H2,18,19,21);1H

1-([1,1'-biphenyl]-3-yl)-4-amino-5-chloropyrimidin-2(1H)-one hydrochloride

Bobcat339; Bobcat-339; Bobcat 339; Bobcat339 HCl; Bobcat339 hydrochloride

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Note: Please store this product in a sealed and protected environment, avoid exposure to moisture.

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : 130 mg/mL (388.99 mM)
H2O : 0.1 mg/mL (0.30 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (6.22 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (6.22 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (6.22 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。