Vehicle for drug delivery

用 HP-β-CD 处理细胞会激活转录因子 EB（溶酶体活性和自噬的基本调节因子），并促进自噬清除 [1]。 HP-β-CD 疗法可降低细胞内胆固醇，并通过 G2/M 细胞周期停滞和死亡有效抑制白血病细胞增殖。暴露72小时后，HP-β-CD的IC50值在3.86-10.09 mM范围内。 HP-β-CD 对携带 T315I BCR-ABL 突变（对大多数 ABL 酪氨酸激酶抑制剂具有抗性）的 CML 细胞和具有白血病干细胞特征的缺氧适应 CML 细胞也显示出抗癌作用。此外，HP-β-CD 会降低人原代 AML 和 CML 细胞的集落形成能力 [2]。

由于溶酶体贮积病患者产生的细胞溶酶体自噬系统活性降低，HP-β-CD 治疗可增加转录因子 EB 介导的蛋白脂质聚集体清除和积累 [1]。当HP-β-CD腹腔注射时，白血病小鼠模型可以具有更高的存活率。全身给予 HP-β-CD 的小鼠没有表现出任何明显的负面影响 [2]。

HP-β-CyD对体外细胞生长的影响[2]
如前所述，使用台盼蓝染料排除法评估细胞存活率，使用改良的甲基噻唑二苯基四氮唑（MTT）试验和SF试剂评估细胞增殖。将包括人原代肝细胞在内的细胞以每孔100μL培养基中1×104个细胞的密度接种在平底96孔板中，并与不同浓度的HP-β-CyD一起孵育72小时。计算每种浓度的三次重复的平均值。

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蛋白质印迹分析[2]
如前所述，使用裂解缓冲液从细胞中制备用或不用HP-β-CyD处理的白血病细胞的全细胞裂解物，并稍作修改。使用10%NuPAGE电泳系统分离蛋白质，转移到硝化纤维膜上，在室温下用5%牛血清白蛋白封闭1小时，并在4°C下与一抗孵育过夜。抗Akt、磷酸化Akt（Thr308或Ser473）、磷酸化Erk1/2（Thr202/Thr204）、磷酸酸化Stat5、Lyn、Stat5、Erk1/2、肌动蛋白和磷酸化Lyn的抗体用作一抗。辣根过氧化物酶偶联免疫球蛋白IgG用作第二抗体。使用增强型化学发光试剂盒进行检测。这些结果代表了至少两个独立的实验。使用ImageJ软件定量背景减除后的免疫印迹信号强度。

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细胞周期分析[2]
如前所述进行人白血病细胞系的细胞周期分析。简而言之，用指定浓度的HP-β-CyD处理1×106个细胞。HP-β-CyD处理后12或24小时，收集细胞并用70%乙醇固定。然后将细胞与0.1%Triton X-100和0.5%RNase A在室温下孵育30分钟，并用50μg/mL碘化丙啶染色。通过流式细胞术分析细胞DNA含量，并使用带有CellQuest软件的FACS Caliber流式细胞仪测定细胞周期特征。数据为三个独立实验的平均值±标准差。

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细胞凋亡检测[2]
根据制造商的说明，通过用7-氨基放线菌素D（7-AAD）和膜联蛋白V对细胞进行染色来进行凋亡测定。细胞在6孔板中以4×105个细胞的密度培养，并与不同浓度的HP-β-CyD一起孵育12或24小时。然后，用7-氨基放线菌素D（7-AAD）和膜联蛋白V-APC对细胞进行染色，并使用带有Diva软件的FACSAriaII系统进行分析。

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造血集落形成试验[2]
如前所述，使用标准甲基纤维素培养试验研究了正常造血祖细胞中HP-β-CyD的毒性。将10周龄C57BL/6N小鼠骨髓中的2×104个单核细胞暴露于1 mL MethoCult M3434中的0、5、15或25 mM HP-β-CyD。培养8天后，使用倒置显微镜计数菌落数量。数据表示菌落的平均数±标准差（n=3）。临床样本是在知情同意的情况下获得的。白血病患者的单核细胞在含有重组细胞因子的半固体培养基中培养。

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胆固醇测定[2]
将白血病细胞（3×106）与5或10 mM HP-β-CyD在37°C的HBSS（pH 7.4）中孵育1、2或3小时。通过离心（3000rpm，5分钟）回收细胞培养上清液。使用胆固醇E-test Wako测定上清液中总胆固醇的浓度。数据为三个实验的平均值±标准差。用甲醇：氯仿（1:2）提取细胞脂质，酶法测定总胆固醇和游离胆固醇。酯化胆固醇的量是通过从总胆固醇中减去游离胆固醇来计算的。通过BCA测定法测定细胞蛋白浓度。数据为三个实验的平均值±标准差。对于filipin染色，将细胞与β-CyDs（10 mM）一起孵育1小时。此后，使用基于胆固醇细胞的检测试剂盒检测细胞胆固醇。

Murine leukemia model[2]
Two different experimental settings were used. The protocol was approved by the Committee on the Ethics of Animal Experiments of the Saga University (Permit number: 25-028-0). First, nude mice were intravenously transplanted with 1×106 EGFP+ Ba/F3 BCR-ABLWT cells. These mice were intraperitoneally injected with 200 μL vehicle (saline) or HP-β-CyD (50 or 150 mM) for 20 consecutive days 3 days after transplantation, and survival was monitored daily. Leukemic cell engraftment was confirmed by detection of GFP-positive cells in the recipient’s BM using flow cytometry.[2]
The second experimental setting involved a human leukemia xenograft model. BV173 cells (1×106) were intravenously injected into sublethally irradiated (2 Gy) NOD/SCID mice. After 72 hours, xenotransplanted mice were intraperitoneally injected with 200 μL vehicle or HP-β-CyD (50 or 150 mM) for 5 consecutive days every week for 13 weeks, and survival was monitored daily. The percentage of human leukemic cells in BM was determined by flow cytometry after double staining with FITC-conjugated anti-human CD19 and PE/Cy7-conjugated anti-mouse CD45 antibodies. All surgery was performed under sodium pentobarbital anesthesia, and all efforts were made to minimize suffering. Mice were euthanized with ether when they became moribund or unable to obtain food or water, as recommended by the institutional guidelines of Saga University. Survival data were analyzed by a log-rank nonparametric test and shown as Kaplan-Meier survival curves (n = 10 for each group).[2]

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Lung histology[2]
HP-β-CyD was administered to NOD/SCID mice for 13 weeks as described in the above section entitled “Murine leukemia model”. Age-matched mice were used as a control. Lungs were perfused with 10% buffered formalin and excised. Tissues were fixed in 10% buffered formalin and embedded in paraffin. These blocks were then sectioned and stained with hematoxylin and eosin (H&E).

[1]. 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin promotes transcription factor EB-mediated activation of autophagy: implications for therapy. J Biol Chem. 2014 Apr 4;289(14):10211-22.

[2]. 2-Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin Acts as a Novel Anticancer Agent. PLoS One. 2015 Nov 4;10(11):e0141946.

Derivative of beta-cyclodextrin that is used as an excipient for steroid drugs and as a lipid chelator.

C63H12O42

1541.54

1540.662

128446-35-5

128446-35-5 ;107745-73-3;

4363642

Typically exists as White to off-white solids at room temperature

1.4±0.1 g/cm3

1521.9±60.0 °C at 760 mmHg

278ºC (dec.)

874.2±32.9 °C

0.0±0.6 mmHg at 25°C

1.545

-6.23

618.66

21

42

28

105

2010

0

CO[C@@H]1[C@H](O[R])[C@@H](O)[C@H](C)[C@@H](CO[R])O1.[C;D2]CC(O)C.[R].[7].[R=H or]

ODLHGICHYURWBS-FOSILIAISA-N

InChI=1S/C63H112O42/c1-22(64)8-85-15-29-50-36(71)43(78)57(92-29)100-51-30(16-86-9-23(2)65)94-59(45(80)38(51)73)102-53-32(18-88-11-25(4)67)96-61(47(82)40(53)75)104-55-34(20-90-13-27(6)69)98-63(49(84)42(55)77)105-56-35(21-91-14-28(7)70)97-62(48(83)41(56)76)103-54-33(19-89-12-26(5)68)95-60(46(81)39(54)74)101-52-31(17-87-10-24(3)66)93-58(99-50)44(79)37(52)72/h22-84H,8-21H2,1-7H3/t22?,23?,24?,25?,26?,27?,28?,29-,30-,31-,32-,33-,34-,35-,36-,37-,38-,39-,40-,41-,42-,43-,44-,45-,46-,47-,48-,49-,50-,51-,52-,53-,54-,55-,56-,57-,58-,59-,60-,61-,62-,63-/m0/s1

(1R,3S,5S,6R,8S,10S,11R,13S,15S,16R,18S,20S,21R,23S,25S,26R,28S,30S,31R,33S,35S,36S,37S,38S,39S,40S,41S,42S,43S,44S,45S,46S,47S,48S,49S)-5,10,15,20,25,30,35-heptakis(2-hydroxypropoxymethyl)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29,32,34-tetradecaoxaoctacyclo[31.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26.228,31]nonatetracontane-36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49-tetradecol

Hydroxypropyl betadex (2-Hydroxypropyl)-β-cyclodextrinHydroxypropyl-β-cyclodextrin; HP-β-CD; (2-Hydroxypropyl)-; A-cyclodextrin; MFCD00069372; HP-??cyclodextrin; ODLHGICHYURWBS-FOSILIAISA-N; HMS3885J22; s4760;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~50 mg/mL
H2O : ~50 mg/mL

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (Infinity mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (Infinity mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (Infinity mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 100 mg/mL (Infinity mM) in PBS (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶 (<60°C).

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配方 5 中的溶解度: 200 mg/mL (Infinity mM) in Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶.
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。