HSP90 (EC50 = 62 nM); GRP94 (EC50 = 65 nM)

人癌细胞系 SKBR3 和 SKOV3 过度表达 Hsp90 蛋白 Her2，其增殖可被盐酸阿维斯匹霉素（17-DMAG 盐酸盐；KOS-1022；BMS 826476）抑制。这导致 Her2 下调和 Hsp70 上调。在SKBR3和SKOV3细胞中Hsp90抑制Her2降解的EC50值分别为8±4nM和46±24nM。同样，SKBR3 和 SKOV3 细胞中 Hsp70 诱导的 EC50 值分别为 4±2 nM 和 14±7 nM [1]。与载体对照相比，在 50 nM 至 500 nM 的浓度（对应于药理学可达到的水平）下，17-DMAG 表现出剂量依赖性细胞凋亡（24 小时和 48 小时时间段的平均值 P<0.001）。在治疗 24 至 48 小时的慢性淋巴细胞白血病 (CLL) 细胞中，盐酸阿维斯匹霉素也表现出时间依赖性细胞凋亡（P < 0.001，所有剂量的平均值），就像许多其他药物一样。此外，治疗24小时和48小时后，盐酸Alvespimycin比17-AAG更有效[2]。

在肿瘤形成前一个月，每四天腹腔注射0、5、10和20 mg/kg 17-DMAG或0、50、100和200 mg/kg二棕榈酰二醇。尽管样本异质性，但用 HSP90 抑制剂治疗的小鼠的肿瘤尺寸比用载体对照治疗的小鼠小得多。已证明HSP90抑制剂在胃肠道癌症动物模型中产生肝毒性。然而，100 mg/kg 的二棕榈酰二醇大大减小了肿瘤大小，10 或 20 mg/kg 的 17-DMAG 也有同样的效果 [3]。

竞争结合测定。[1]
从HeLa细胞（SPP-770）和重组犬Grp94（SPP-766）中分离的天然人Hsp90蛋白（α+β异构体）购自Stressgen Biotechnologies。基于FP的结合测定的程序改编自Chiosis及其同事所描述的程序。42，43 BODIPY-AG溶液在FP测定缓冲液（20mM HEPES−KOH，pH 7.3，1.0mM EDTA，100mM KCl，5.0mM MgCl2，0.01%NP-40，0.1mg/mL新鲜牛γ-球蛋白（BGG），1.0mM新鲜DTT和完全蛋白酶抑制剂）中从DMSO的储备溶液中新鲜制备。通过在384孔微孔板中混合等体积（10μL）的BODIPY-AG溶液和连续稀释的人Hsp90（或Grp94）溶液获得结合曲线，得到10nM的BODIPY-AG、不同浓度的Hsp90和0.05%DMSO。在30°C下孵育3小时后，在EnVision 2100多标签板读取器上测量荧光各向异性（λEx=485 nm，λEm=535 nm）。通过混合每种含有BODIPY-AG和Hsp90（或Grp94）的溶液10μL，以及从DMSO中的储备溶液在FP测定缓冲液中新制备的每种化合物的连续稀释，获得竞争曲线。最终浓度为10 nM BODIPY-AG、40或60 nM Hsp90（或Grp94）、不同浓度的每种化合物（0.10 nM−10μM）和≤0.25%二甲基亚砜。由于化合物（1−3）a在中性pH下易于氧化，因此在氮气氛下，在LabMaster手套箱（M.Braun，Stratham，NH）中与醌类化合物（1–3）b平行进行这些化合物的测定。通常，将Hsp90蛋白溶液和化合物储备溶液作为冷冻液体放入手套箱中，并在FP测定缓冲液中制备结合混合物，该缓冲液通过重复的抽空和氩气冲洗循环脱氧。孵育后，将微孔板从手套箱中取出，并立即测量荧光各向异性。有趣的是，BODIPY-AG与Hsp90的结合导致荧光各向异性（FA）和强度的同时增加，而与Grp94的结合使荧光强度的变化相对较小。为每个结合或竞争曲线收集三份数据点。竞争结合曲线由四参数逻辑函数拟合[1]。

---

17-AAG与Hsp90（配合物）的分离。[1]
使用旋转柱测定法测定1b在细胞裂解物中从纯化的人Hsp90蛋白或Hsp90复合物的解离速率。[烯丙基氨基-3H]-17-AAG（20 Ci/mmol，HPLC纯度≥97%）购自商业。在真空下干燥200μCi（10nmol）的[3H]-17-AAG在乙醇中，并与30nmole的未标记1b在DMSO中混合，得到1mM[3H]-17AAG的储备溶液，SA为3×106−4×106 cpm/nmol。结合反应在测定缓冲液（20mM HEPES−KOH，pH 7.3，1.0mM EDTA，100mM KCl，5.0mM MgCl2，0.01%NP-40，1.0mM新鲜DTT和完全蛋白酶抑制剂）中含有400 nM Hsp90、4.0μM[3H]-17-AAG和0.38 mg/mL BGG。牛γ-球蛋白仅作为纯化的Hsp90蛋白的载体蛋白。或者，使用来自正常人真皮成纤维细胞（NHDF，5.0mg/mL总蛋白）或乳腺癌症细胞系SKBR3（1.5mg/mL）的细胞裂解物（如Kamal等人20所述制备）代替纯化的Hsp90蛋白。在37°C下孵育≥2小时后，将65μL的结合反应依次通过两个Zeba脱盐旋转柱以去除未结合的配体。在解离反应（650μL）中，用未标记的1b稀释含有结合[3H]-17-AAG的脱盐蛋白质溶液，以在测定缓冲液中得到约40 nM Hsp90、40μM 17-AAG和0.48 mg/mL BGG的最终浓度。类似地，用最终浓度为20μM的1b将脱盐的细胞裂解物稀释10倍。未标记的17-AAG以超过Hsp90≥1000倍的量存在，以确保[3H]-17-AAG的解离实际上是不可逆的。在不同的孵育时间（37°C），取出60μL的解离反应，并依次通过两个Zeba旋转柱。在MicroBeta微板闪烁计数器上分析流通部分。离解动力学用单指数函数a=A0×exp-kt+a∞拟合，得到一阶速率常数k。

活力测定。[1]
人癌症细胞系SKBR3和癌症细胞系SKOV3从美国典型培养物保藏中心获得，并在添加有10%热灭活FBS、50单位/mL链霉素和50单位/mL青霉素的RPMI-1640培养基中在37°C和5%CO2中培养。在进行实验之前，用0.05%胰蛋白酶和0.02%EDTA在不含钙和镁的磷酸盐缓冲盐水中解离细胞。 使用重要线粒体功能染色剂Alamar Blue（Biosource International，Camarillo，CA）进行可行性研究。在存在或不存在化合物的情况下，将细胞在96孔板（200μL）中孵育后，加入20μL Alamar Blue溶液，并将板在37°C下孵育4−6小时。在λEx=544 nm和λEm=590 nm处通过荧光监测Alamar Blue信号的减少。

---

Her2和Hsp70全细胞免疫检测。[1]
对于全细胞免疫检测，将20000个细胞接种到200μL生长培养基中的96孔微量滴定板中，并在37°C下附着在板上过夜。将补充有化合物或载体（DMSO或75 mM柠檬酸盐缓冲液，75 mM抗坏血酸盐，pH 3.0−3.3）的生长培养基加入孔中，并在37°C下再次孵育平板。在不同的孵育时间后，用70μL含有0.1%吐温20（TBST）的冰冷Tris缓冲盐水洗涤细胞两次，并吸出上清液。然后将冰冷的甲醇（50μL）加入每个孔中，并将平板在4°C下孵育10分钟。用TBST（2×100μL）洗涤除去甲醇。将平板进一步与100μL SuperBlock一起孵育，或在室温下孵育1小时，并在4°C下与一级抗体（抗Her2或抗Hsp70，Santa Cruz Biotechnology，Santa克鲁兹，CA）在SuperBlock中以1:200的稀释度孵育过夜。用TBST（2×100μL）洗涤每个孔，并在室温下与辣根过氧化物酶连接的第二抗体（50μL，在SuperBlock中为1:1000，与Hoechst试剂在1:5000下孵育）一起孵育。用TBST（2×100μL）洗涤除去未结合的抗体后，加入化学发光底物溶液（20μL）。5分钟后，通过在Envision微孔板读取器上以发光模式扫描每个孔0.1s来读取板。使用省略了第一抗体的孔的读数作为背景。然后在荧光模式下读取板（λEx=340nm和λEm=460nm）。相对荧光单位（RFU）值用于归一化相对发光单位（RLU）值，以给出每细胞数的发光强度。将从化合物处理的细胞与载体处理的细胞获得的比率绘制为药物浓度的函数，以产生EC50值。

Young male CB-17/IcrHsd-Prkdc-SCID mice, are used. Recombinant xenografts are made by mixing 1×105 BPH1 cells and 2.5×105 CAF per graft in collagen solution, allowed to gel, covered with medium and cultured overnight. Tumors are allowed to form over eight weeks, and then treated for four weeks with three different doses of dipalmitoyl-radicicol (50, 100 and 200 mg/kg) and 17-DMAG (5, 10 and 20 mg/kg) via intraperitoneal injections of compounds in sesame oil every four days. After 12 weeks in total, the mice are sacrificed, their kidneys resected, grafts cut in half and photographed before processing for histology. Graft dimensions are measured and the resultant tumour volume is calculated using the formula; volume=width×length×depth×π/6. This formula represents a conservative approach to evaluate tumour volumes, as it understates the volume of large, invasive tumours compared with smaller, non-invasive tumours. Resected grafts are fixed in 10% formalin, embedded in paraffin and processed for immunohistochemistry[3].

---

Dissolved in DMSO; 10 mg/kg; i.p. injection

SCID mice engrafted with TCL1 leukemia cells

[1]. Design, synthesis, and biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-demethoxygeldanamycin as potent, water-soluble inhibitors of Hsp90. J Med Chem. 2006 Jul 27;49(15):4606-15.

[2]. 17-DMAG targets the nuclear factor-kappaB family of proteins to induce apoptosis in chronic lymphocytic leukemia: clinical implications of HSP90 inhibition. Blood. 2010 Jul 8;116(1):45-53.

[3]. Reduced Contractility and Motility of Prostatic Cancer-Associated Fibroblasts after Inhibition of Heat Shock Protein 90. Cancers (Basel). 2016 Aug 24;8(9). pii: E77.

Alvespimycin Hydrochloride is the hydrochloride salt of alvespimycin, an analogue of the antineoplastic benzoquinone antibiotic geldanamycin. Alvespimycin binds to HSP90, a chaperone protein that aids in the assembly, maturation and folding of proteins. Subsequently, the function of Hsp90 is inhibited, leading to the degradation and depletion of its client proteins such as kinases and transcription factors involved with cell cycle regulation and signal transduction.

C32H48N4O8.HCL

653.21

652.324

C, 58.75; H, 7.40; Cl, 5.42; N, 6.42; O, 22.01

467214-21-7

Alvespimycin;467214-20-6

9852573

Typically exists as purple to purplish red solids at room temperature

3.895

174

5

10

8

45

1230

6

Cl[H].O(C([H])([H])[H])[C@@]1([H])[C@]([H])([C@]([H])(C([H])([H])[H])C([H])=C(C([H])([H])[H])[C@]([H])([C@@]([H])(C([H])=C([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C(N([H])C2=C([H])C(C(=C(C2=O)C([H])([H])[C@@]([H])(C([H])([H])[H])C1([H])[H])N([H])C([H])([H])C([H])([H])N(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])=O)=O)OC([H])([H])[H])OC(N([H])[H])=O)O[H] |c:17,32,t:28|

BXRBNELYISPBKT-BJGZLATJSA-N

InChI=1S/C32H47N3O9.ClH/c1-18-14-22-28(38)23(17-24(36)30(22)43-13-12-35(5)6)34-31(39)19(2)10-9-11-25(41-7)29(44-32(33)40)21(4)16-20(3)27(37)26(15-18)42-8;/h9-11,16-18,20,25-27,29,37H,12-15H2,1-8H3,(H2,33,40)(H,34,39);1H/b11-9-,19-10+,21-16+;/t18-,20+,25+,26+,27-,29+;/m1./s1

(4E,6Z,8S,9S,10E,12S,13R,14S,16R)-19-(2-(dimethylamino)ethoxy)-13-hydroxy-8,14-dimethoxy-4,10,12,16-tetramethyl-3,20,22-trioxo-2-azabicyclo[16.3.1]docosa-1(21),4,6,10,18-pentaen-9-yl carbamate hydrochloride

Alvespimycin; Alvespimycin HCl; Alvespimycin Hydrochloride; NSC 707545; BMS 826476 HCl; KOS 1022; NSC-707545; BMS-826476 HCl; KOS-1022; NSC707545; BMS826476 HCl; KOS1022

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.83 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.83 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

---

View More

配方 3 中的溶解度: 1% DMSO+30% polyethylene glycol+1% Tween 80: 30 mg/mL

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。