Yoda1

ERK1/2

Akt 和 ERK1/2 由 Yoda1 以不依赖于 Piezo1 的方式激活（0–6 μM，5 分钟）[2]。 Yoda1（1.5 μM，5 分钟）可抑制 Rac1 激活 [3]。

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Piezo1的抑制或激活影响体外ICH模型中HT22细胞的凋亡[1]
根据Wang等人（2022）建立了体外ICH模型。我们首先用不同浓度（0、10、20、40、60、80、100、120或140μM）的氯化血红素溶液处理体外培养的HT22细胞，以找出氯化血红素的IC50。我们发现氯化血红素的IC50为100μM（图6a）。然后，我们使用IC50（100μM）的氯化血红素溶液处理HT22细胞24小时，观察氯化血红素对HT22细胞存活率和HT22细胞中指定基因蛋白质水平的影响。在氯化血红素处理后1小时，表面上就观察到HT22细胞变小变圆的异常形态变化（图6b）。活细胞计数的定量分析显示，氯化血红素处理24小时后，活HT22细胞的数量减少了50%（图6c）Yoda-1（一种Piezo1激活剂）处理进一步减少了用氯化血红素预处理的活HT22细胞的数量。相比之下，GsMTx4（Piezo1阻断剂）治疗显著逆转了氯化血红素预处理后活HT22细胞数量的大幅减少（图6c）。

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Yoda-1诱导内皮细胞中Akt和ERK1/2的激活。 钆（Gd3+）可以消除Yoda-1对Akt的激活，但不能激活ERK1/2。 钌红（RR）能有效阻断Yoda1诱导的Akt激活。 GsMTx4是Piezo1的强效阻断剂，不会抑制Yoda1诱导的Akt或ERK1/2磷酸化。[2]

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Yoda-1对EGF刺激的大颗粒细胞增多的抑制作用依赖于Piezo1。 KCa3.1激活是Yoda-1抑制褶皱形成所必需的。 在这项研究中，我们发现，Yoda-1处理导致Rac1活化受到抑制，从而抑制了外周膜褶皱的形成（图3）。据报道，在癌症细胞中敲低Piezo1导致Rac1激活51。这项先前的研究可能表明Piezo1激活抑制Rac1，尽管其机制尚不清楚。重要的是，我们进一步表明，Yoda1对大白细胞增多的抑制作用取决于通过Piezo1的细胞外Ca2+内流（图4）。即使在Yoda1存在的情况下，对钙激活钾通道KCa3.1的抑制也恢复了EGF刺激的膜褶皱形成（即肌动蛋白重排）（图5A，B）。这表明，在KCa3.1被抑制的条件下，即使在Yoda1存在的情况下，EGF刺激的肌动蛋白重排也可以被诱导。因此，我们提出Piezo1激活后KCa3.1激活可能导致肌动蛋白重排的抑制。之前的一项研究报告称，KCa3.1的激活在膜褶皱闭合中至关重要，这是大细胞吞噬过程的后期21。另一方面，我们发现KCa3.1激活剂和Yoda1也会损害大白细胞增多症（图5C-E）。总之，我们的结果表明，KCa3.1的适当时间激活在大白细胞增多症中很重要，在Yoda1诱导的急性Ca2+内流后，KCa3-1的激活可能会导致肌动蛋白重排的抑制（图5F）[3]。

脑出血后继发性脑损伤是脑出血患者预后不良的主要原因，但其潜在机制尚不清楚。在脑出血小鼠模型中研究了Piezo1在脑出血后脑损伤中的作用。ICH是通过将自体动脉血注入小鼠基底节而建立的。将载体、Piezo1阻断剂、GsMTx4、Piezo-1激活剂、Yoda-1或与甘露醇（尾静脉注射）一起注射到小鼠脑左侧脑室后，通过各种指示方法确定Piezo1水平以及Piezo1在脑出血后神经元损伤、脑水肿和神经功能障碍中的作用。脑出血后24小时，神经元中的Piezo1蛋白水平显著上调（人和小鼠）。作为体外ICH模型，氯化血红素处理后24小时，体外培养的HT22细胞（一种小鼠神经元细胞系）中Piezo1蛋白水平也显著上调。GsMTx4治疗或与甘露醇一起显著下调Piezo1和AQP4水平，显著提高Bcl2水平，维持更多神经元存活，显著恢复脑血流，显著缓解脑水肿，显著降低血清IL-6水平，并几乎完全逆转ICH 24小时组小鼠的神经功能障碍。相比之下，Yoda-1处理达到了相反的效果。综上所述，Piezo1在脑出血后脑损伤的发病机制中起着至关重要的作用，可能成为脑出血临床治疗的靶点。[4]

384-well格式[1]
转染后2天，使用ELx405 CW洗板机用测定缓冲液（1×HBSS，10 mM HEPES，pH7.4）洗涤细胞。将细胞与含有4μM Fluo3和0.04%Pluronic F-127的测定缓冲液一起孵育约60分钟，然后再次用测定缓冲液洗涤。在荧光成像板阅读器（FLIPR）Tetra上监测荧光。为了螯合细胞外钙（1×HBSS含有1.26 mM CaCl2），在2 mM EGTA存在下，在加入指定浓度的Yoda1前1分钟向细胞中加入2 mM乙二醇四乙酸（EGTA）。为了消耗细胞内钙，在加入Yoda1前15分钟加入7.5μM的thapsigargin。使用Yoda1在二甲亚砜（DMSO）中的10mM储备溶液，在测定中产生最多1%的DMSO。使用可变斜率的S形剂量反应拟合浓度反应曲线。[1]

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1536-well高通量筛选格式[1]
为了鉴定Piezo1或Piezo2激动剂，我们用等量的mPhoto1和mPhoto2 cDNA共转染细胞。2天后，根据制造商的说明，将转染细胞与Calcium5一起孵育，并在FLIPR Tetra上监测荧光。从LMW诺华筛选库中筛选了约325万种化合物，其中包括公共领域和专有药物样分子，浓度为5μM。在共转染细胞以及单个Piezo1和2转染和对照细胞中，选择约9000次点击（定义为DMSO对照孔上方50%的激活）进行重新测试。由此，Yoda1被确定为潜在的Piezo1激活剂，并被选中进行进一步研究。

蛋白质印迹分析
细胞类型：人冠状动脉内皮细胞 (HCAEC) [2]、A431 细胞 [3]
测试浓度： 0、1.5、 3.0 和 6.0 μM
孵育时间： 5 分钟
实验结果：诱导 Akt 和 ERK1/2 激活，并提高 Akt 和 ERK1/2 的磷酸化水平呈剂量依赖性。抑制 EGF 诱导的 Rac1-GTP 量增加并抑制 Rac1 激活.

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体外intracerebral hemorrhage (ICH) 模型[4]
通过氯化血红素处理体外培养的HT22细胞（一种小鼠海马神经元细胞系）来模拟体外ICH模型。根据Wang等人（2022）的研究，HT22细胞与DMEM（10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素）预培养12小时。然后，将每种不同浓度（0、10、20、40、60、80、100、120或140μM）的氯化血红素溶液加入细胞培养基中，再培养24小时的HT22细胞。对于GsMTx4或Yoda-1治疗组，在向HT22细胞中添加氯化血红素1小时后添加GsMTx4或Yoda-1。

Inhibition or activation of Piezo1 after intracerebral hemorrhage (ICH) in mice[4]
The effects of Piezo1 blocker, GsMTx4, and Piezo1 activator, Yoda-1, on brain edema and neurological dysfunctions after ICH were studied in 27 mice. The mice were divided into five groups, (1) control (n = 6), (2) ICH 24 h (n = 6), (3) ICH 72 h (n = 3), (4) ICH 24 h + GsMTx4 (3 μM, n = 6), and (5) ICH 24 h + Yoda-1 (10 μM, n = 6). Please refer to the Supplementary Materials and Methods file (Appendix A Supplementary data) for details.

[1]. Chemical activation of the mechanotransduction channel Piezo1. Elife. 2015 May 22:4:e07369.

[2]. Yoda1-induced phosphorylation of Akt and ERK1/2 does not require Piezo1 activation. Biochem Biophys Res Commun. 2018 Feb 26;497(1):220-225.

[3]. Piezo1 activation using Yoda1 inhibits macropinocytosis in A431 human epidermoid carcinoma cells. Sci Rep. 2022 Apr 15;12(1):6322.

[4]. Roles of mechanosensitive ion channel PIEZO1 in the pathogenesis of brain injury after experimental intracerebral hemorrhage. Neuropharmacology . 2024 Jun 15:251:109896.

Yoda 1 is a member of the class of thiadiazoles that is 1,3,4-thiadiazole substituted by pyrazin-2-yl and (2,6-dichlorobenzyl)sulfanediyl groups at positions 2 and 5, respectively. It is a selective activator of mechanosensitive channel piezo1. It has a role as a glycine transporter 2 inhibitor and a piezo1 agonist. It is an aromatic compound, a member of pyrazines, a member of thiadiazoles, an organic sulfide and a dichlorobenzene.

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Piezo ion channels are activated by various types of mechanical stimuli and function as biological pressure sensors in both vertebrates and invertebrates. To date, mechanical stimuli are the only means to activate Piezo ion channels and whether other modes of activation exist is not known. In this study, we screened ~3.25 million compounds using a cell-based fluorescence assay and identified a synthetic small molecule we termed Yoda1 that acts as an agonist for both human and mouse Piezo1. Functional studies in cells revealed that Yoda1 affects the sensitivity and the inactivation kinetics of mechanically induced responses. Characterization of Yoda1 in artificial droplet lipid bilayers showed that Yoda1 activates purified Piezo1 channels in the absence of other cellular components. Our studies demonstrate that Piezo1 is amenable to chemical activation and raise the possibility that endogenous Piezo1 agonists might exist. Yoda1 will serve as a key tool compound to study Piezo1 regulation and function. [1]

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Piezo1 is a mechanosensitive cation channel that is activated by shear stress in endothelial cells (ECs). It has been shown to mediate shear-induced EC responses, including increased calcium influx, and vascular functions, such as vascular tone and blood pressure. Yoda1, a selective Piezo1 activator, has been shown to mimic shear-induced responses in ECs. Since shear-induced calcium influx causes Akt and ERK1/2 activation in ECs, we examined the effects of Yoda1 and the role of Piezo1 on their activation. Here, we show that Yoda1 robustly activates Akt and ERK1/2 in ECs. Additionally, the Piezo1 antagonists, gadolinium and ruthenium red, but not GsMTx4, effectively blocks Yoda1-induced Akt activation. Our results suggest that Yoda1-induced Akt and ERK1/2 activation is not dependent on Piezo1. [2]

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Macropinocytosis is a type of endocytosis accompanied by actin rearrangement-driven membrane deformation, such as lamellipodia formation and membrane ruffling, followed by the formation of large vesicles, macropinosomes. Ras-transformed cancer cells efficiently acquire exogenous amino acids for their survival through macropinocytosis. Thus, inhibition of macropinocytosis is a promising strategy for cancer therapy. To date, few specific agents that inhibit macropinocytosis have been developed. Here, focusing on the mechanosensitive ion channel Piezo1, we found that Yoda1, a Piezo1 agonist, potently inhibits macropinocytosis induced by epidermal growth factor (EGF). The inhibition of ruffle formation by Yoda1 was dependent on the extracellular Ca2+ influx through Piezo1 and on the activation of the calcium-activated potassium channel KCa3.1. This suggests that Ca2+ ions can regulate EGF-stimulated macropinocytosis. We propose the potential for macropinocytosis inhibition through the regulation of a mechanosensitive channel activity using chemical tools. [3]

C13H8CL2N4S2

355.265417098999

353.956

C, 43.95; H, 2.27; Cl, 19.96; N, 15.77; S, 18.05

448947-81-7

448947-81-7;

2746822

White to light yellow solid powder

1.6±0.1 g/cm3

538.4±60.0 °C at 760 mmHg

279.4±32.9 °C

0.0±1.4 mmHg at 25°C

1.714

4.89

105

0

6

4

21

329

0

C1=CC(=C(C(=C1)Cl)CSC2=NN=C(S2)C3=NC=CN=C3)Cl

BQNXBSYSQXSXPT-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C13H8Cl2N4S2/c14-9-2-1-3-10(15)8(9)7-20-13-19-18-12(21-13)11-6-16-4-5-17-11/h1-6H,7H2

2-[5-(2,6-Dichloro-benzylsulfanyl)-[1,3,4]thiadiazol-2-yl]-pyrazine

Yoda1; Yoda-1; GlyT2-IN-1; YODA-1; 2-((2,6-dichlorobenzyl)thio)-5-(pyrazin-2-yl)-1,3,4-thiadiazole; TW6GF9RW6S; 2-[(2,6-dichlorophenyl)methylsulfanyl]-5-pyrazin-2-yl-1,3,4-thiadiazole; Yoda 1

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~15.62 mg/mL (~43.97 mM)
Ethanol : ~5 mg/mL (~14.07 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1.56 mg/mL (4.39 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 15.6mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 1.56 mg/mL (4.39 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 15.6 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。